乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达的研究＊

陕西省人民医院 （西安710068） 党 珊 陈 谱 张冰斐 张 健 周 健 史丽萍

近年来研究认为肿瘤的发生、发展存在免疫微环境的紊乱，调节性T细胞（Treg）由于具有免疫抑制功能，在肿瘤免疫方面具有重要意义。转录因子Foxp3被认为是Treg细胞发育和功能维持的主要调节基因，能增强Treg细胞的免疫抑制功能，下调机体抗肿瘤免疫应答。进一步研究证实，在T细胞活化过程中，位于Foxp3基因第一外显子的一个CpG岛控制着Foxp3的表达。CpG岛的甲基化状态与外周血中Treg细 胞 表 达 Foxp3 有 关［1－2］。 乙 型 肝 炎 病 毒（HBV）感染是原发性肝癌（HCC）的首要病因，约占病因的50%［3］。大量研究表明HBV及其编码蛋白对宿主基因，尤其是肿瘤相关调控转录基因的影响，在HBV致癌过程中发挥重要作用，但机制仍不十分清楚。本实验从肿瘤免疫及表观遗传学角度入手，研究转录因子Foxp3启动子区的甲基化在乙肝相关性肝癌患者中的水平，探讨Foxp3在乙肝相关性肝癌发病中的意义，为乙肝相关性肝癌的治疗提供新的思路。

对象与方法

1 研究对象 选自2010年1月到2012年1月于第四军医大学西京医院肝胆外科住院的HCC手术患者的癌组织34例。肝癌组织标本参照美国肝病学会（2000）消化系统肿瘤分类进行临床和病理学诊断，入选患者诊断及临床病理资料均明确。伴有人类自身免疫缺陷病毒感染以及酒精性、自身免疫性肝病，丙肝患者均被除外，且每位患者在留取组织标本前均未接受放化疗及免疫治疗。本研究获得西京医院伦理委员会通过，并经患者知情同意。

2 主要仪器及试剂 酚氯仿异戊醇购自Wolsen公司，Bisulfite清洗柱购自Promega公司，焦磷酸试剂盒购自Qiagen公司，琼脂糖微珠购自GE Healthcare公司，RNA提取试剂盒TRIzol Reagant为Invitrogen公司产品，逆转录试剂盒购自Gibco公司，荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司，引物由上海Invitrogen公司合成。RT－PCR仪购自BIO－RAD公司，焦磷酸测序仪购自Qiagen公司。

3 肝癌细胞中Foxp3mRNA检测 采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，逆转录后得到cDNA后行real time RT－PCR，Foxp3引物正义：5’－ttctgtcagtccacttcacca－3’，反义5’－cacccaaagcctcagacct－3’；内参照18S引物正义：5’－cgccgctagaggtgaaattc－3’，反 义 5’－ctttcgctctggtccgtctt－3’。

4 焦磷酸测序 经过Bisulfite处理的DNA通过焦磷酸测序的方法检测Foxp3启动子区的甲基化水平。准备8联管及琼脂糖微珠固定体系，在24孔板中加入25μl 0.3μM的测序引物，在真空泵中捕获微珠，清洗，释放微珠捕获的DNA，80℃孵育3min，室温冷却。根据提示往试剂仓中加入相应的碱基、酶和底物，上机检测。

5 统计学方法 数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差描述，组间比较在满足正态性和方差齐性要求时采用t检验；不满足正态性和方差齐性要求时采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Foxp3mRNA在HBV阳性及阴性肝癌组织中的表达 Foxp3mRNA在29例HBV阳性肝癌组织中为10.318±13.672，高于在5例HBV阴性肝癌组织中的表达3.510±2.414，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2 HBV阳性和阴性肝癌组织中Foxp3甲基化水平 见图1。Foxp3的甲基化水平在HBV阳性肝癌组织与HBV阴性肝癌组织中无明显差异，A－E5个位点均不具有统计学意义（P＞0.05）。图2显示焦磷酸测序的5个甲基化位点。

图1 Foxp3 5个常见甲基化位点的甲基化水平在HBV阳性和阴性肝癌组织中的比较

讨 论

研究认为，肝癌组织中Treg细胞数量较癌旁组织、正常肝组织明显增多，且与HCC的TNM分期、预后有关［4－5］。此外Treg细胞在维持对自身和外来抗原的免疫耐受中起重要作用，并可能参与HBV感染慢性化的过程，也就是说一方面可以抑制过度免疫病理损伤，另一方面也可能有利于病毒的持续感染［6］。这群细胞免疫调节功能的发挥与转录因子Foxp3的持续表达密切相关，Foxp3被看作是最重要且最具特异性的Treg细胞的标志。

本研究中HBV阳性肝癌组织中Foxp3mRNA的表达水平高于对照组，有统计学意义，提示HBV感染可上调Foxp3mRNA表达，据以往报道及该结果推测肝组织中Foxp3水平的增高可能是机体调节过度免疫反应的一种机制，HBV感染增加了进展为肝癌的风险［7］。该结果有助于加深我们对乙型肝炎免疫发病机制的认识，对阐明HBV逃逸机体免疫反应、引起持续性感染的机制具有重要意义。

最新研究表明Foxp3长期、稳定存在离不开以DNA甲基化为代表的表观遗传学调控，而关于乙肝相关性肝癌中Foxp3甲基化的水平，目前国内外文献尚未见报道。本实验结果显示HBV阳性与阴性肝癌组织中Foxp3的甲基化水平不具有统计学差异，这说明乙肝相关性肝癌中引起Foxp3升高的调控机制可能与甲基化无关，或者调控方式是多方面的，甲基化可能不起主要作用。

综上所述，本研究发现HCC患者中HBV感染使Foxp3mRNA表达升高，Foxp3mRNA表达升高可能不是或不完全是通过甲基化修饰来调控的。进一步可在细胞水平敲除HBx蛋白观察Foxp3甲基化水平的变化来证实二者的关系，此外，乙肝相关性肝癌的免疫发病机制是复杂的，寻找有效调控Foxp3mRNA表达的手段对乙肝相关性肝癌的治疗有重要意义。

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