生物活性玻璃/壳聚糖/羟基磷灰石复合骨修复材料制备及细胞相容性研究*

成昊祝少博* 孙晨,禹志宏 金林

论著·实验研究

生物活性玻璃/壳聚糖/羟基磷灰石复合骨修复材料制备及细胞相容性研究*

成昊1,2祝少博1* 孙晨1,3禹志宏3金林1

目的设计一种生物活性玻璃/壳聚糖/羟基磷灰石 (BG/HA/CS)复合材料的骨组织工程支架，并对其理化性能和细胞相容性进行检测。方法不同比例的BG/HA/CS混合液用冷冻干燥法制备成支架。通过计算支架孔隙率；扫描电镜、X线衍射和傅立叶红外光谱分析其微观形貌和组成；采用材料试验机进行支架的机械性能检测，并评价生物活性玻璃的加入对支架的影响。将第3代兔骨髓间充质干细胞接种于支架上，使用扫描电镜检测支架对其粘附作用，采用MTT法检测细胞在支架上增殖，并评价生物活性玻璃的加入对支架的细胞相容性影响。结果合成的BG/CS/HA支架与模具拥有同样的大小及几何形状，具有相互贯通的多孔结构，未见生物活性玻璃聚集，孔隙率最高可达86.96%，孔径大小合适 (100～300um)，最大压缩强度为 (1.95±0.13)Mpa。X射线衍射图可以看到特征性的BG衍射峰；傅立叶变换红外光谱可见特征的BG吸收峰，这表明材料内有明确的BG；第3代兔骨髓间充质干细胞在支架上共培养1天后，细胞在支架表面粘附。部分细胞伸展，并伸出伪足。共培养5天后，可见细胞数目增多，团聚，细胞表面可见微绒毛，细胞已开始向材料内部迁移。采用MTT法测量骨髓间充质干细胞在支架上的增殖情况可以看出骨髓间充质干细胞在BG/CS/HA支架上表现出了明显的增殖。结论采用溶液共混、冷冻干燥法可以制备出 BG/CS/HA支架；支架具有良好的孔隙率，较好的机械强度，良好的组织相容性，可用于骨组织工程。

生物活性玻璃；羟基磷灰石；壳聚糖；组织工程；骨

临床上骨缺损十分常见[1-3]。有关羟基磷灰石/壳聚糖支架已有较多研究、报道。但是用羟基磷灰石/壳聚糖支架强度欠缺[4-7]。AW生物活性玻璃 (Bioactive glass,BG：CaOMgO-SiO2-P2O5-CaF2)是一种多相复合材料，在现有的生物活性玻璃中，其机械性能最佳。为了修正羟基磷灰石/壳聚糖支架缺点，本实验用生物活性玻璃与羟基磷灰石/壳聚糖用冷冻干燥法制备支架。检测其性能及细胞相容性，为其作为组织工程支架材料和进一步医学应用打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

AW生物活性玻璃 (由武汉理工大学辅材研究所提供)、羟基磷灰石(国药集团化学试剂有限公司)、壳聚糖(脱乙酰度≧92%)、浓盐酸、25%戊二醛、乙醇 (分析纯)。

1.2 主要仪器

NeXus傅立叶变换红外光谱仪(美国ThermoNicolet公司)，DMAX-ⅢA型X射线衍射仪(日本RIGAGO公司)，MTS810陶瓷试验系统(美国MTS公司)，扫描电镜(S-570，日本日立公司)，真空烘干箱 (D2F-1厦门德仪设备有限公司)，电子天平 (JA2003A上海沪西分析仪器厂有限公司)，DSC热分析仪(美国PerkinElmer公司)，90-3型双向定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂有限公司)，PH计(Delta320型上海沪西分析仪器厂有限公司)，冷冻干燥机(FD-1A-80上海楚定分析仪器有限公司)。

1.3 中性壳聚糖溶液的制备

A液的配制：取5 g壳聚糖 (本实验采用的壳聚糖脱乙酰度≧92%)制成壳聚糖终浓度为2.0%的0.1mmol/ml的稀盐酸溶液200 ml，用磁力搅拌器的搅拌24小时后CS完全溶解。后放置于4℃冰箱保存。B液得配制：称量14 g-甘油磷酸钠，加三蒸水至总溶液量为25 ml，搅拌至其完全溶解后过滤除菌4℃保存备用。将A液与B液以7∶1的体积比在冰浴条件下混合搅拌，并调节pH值至中性。

1.4 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的制备

称取0.5克HA加入100mlCS溶液中，搅拌6小时，制成HA∶CS质量比为1∶2的HA/CS共混液。电子天平分别称取0.125g/0.25g/0.5g生物活性玻璃加入上述HA/CS共混液，冰浴下搅拌48小时后再静置12小时，分别制成理论质量比BG∶HA∶CS为0.25∶1∶2；0.5∶1∶2；1∶1∶2的BG∶HA∶CS混合液。注入模具放置于—80℃冷冻，在用冷冻干燥机成型。20kGy 60Co辐射灭菌后得到样品。

1.5 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的理化特征和力学性能

①形态学观察：采用扫描电镜进行生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架表面形貌及断口形貌观察，采用液体置换法测定支架的孔隙率。

②力学性能分析：将样品制成半径为10mm，高25mm的圆柱体，材料试验机上进行测试。每种比例生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料测试5个样本，取均值。采用液体置换法测定支架的孔隙率。

③表面性能分析：将样品制成半径为10mm，高25mm的圆柱体，表面磨平后在DMAX-ⅢA型X射线衍射仪分析材料的化学组成及结晶度。采用Nexus傅立叶变换红外光谱仪分析材料的化学组成。采用DSC热分析检测支架材料的耐热性。

1.6 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的细胞相容性

①与兔BMSCs共培养：取1∶1∶2生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架为实验组，用锋利刀片切成2mm薄片置入96孔板底部，置入后密封96孔板并再次20kGy60Co辐射灭菌。取第3代兔骨髓间充质干细胞 (BMSCs)，调整细胞浓度为2×105个∕ml细胞悬液，每片支架上均匀滴加100ul细胞悬液，静置4小时后再沿孔壁每孔缓慢加入1.5ml完全培养液。置于37℃，5%CO2培养箱培养。对照组羟基磷灰石/壳聚糖支架采用相同处理。2组均放入培养箱中培养，隔天换液。

②细胞增殖试验测定：实验组及对照组支架 (96孔板内)，均在与BMSCs细胞共培养1、2、3、4天后加入MTT液20ul/孔，继续培养4小时后弃原液并加入DMSO液150ul/孔，微孔板振荡器振荡10分钟，酶标仪检测各孔 OD值（570nm），比色时选用空白对照孔。

③扫描电镜观察：倒置相差显微镜每天观察生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架上培养的BMSCs细胞，以观察支架材料对细胞生长、增殖、迁移、细胞形态、基质分泌变化的影响。复合培养5天后，扫描电镜观察BMSCs在支架上的粘附、增殖情况。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的大体形态观察及扫描电镜观察

可以用不同模具在制造生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料，可以证明本支架可塑性强。图1、2显示本支架具有孔孔贯通的结构，不同的层次也有孔道相连，未见羟基磷灰石晶体聚集，未见生物活性玻璃集聚，说明羟基磷灰石和生物活性玻璃已充分分散。孔径大小约在100～300um。有利于细胞及组织生长三维空间结构。

图1 BG/HA/CS(1∶1∶2)支架材料电镜观(×100)

图2 BG/HA/CS(1∶1∶2)支架材料电镜观(×50)

2.2 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架的力学性能及孔隙率检测

表1 复合材料的理化特性和力学性能（±S，n=5）

表1 复合材料的理化特性和力学性能（±S，n=5）

样品组 BG/HA/CS比例 孔隙率 (%) 压缩强度 (MPa) 0.88±0.17 1234 0∶1∶289.70±2.12 0.25∶1∶2 88.67±1.78 87.77±1.43 86.96±1.27 1.95±0.13 1.18±0.67 0.5∶1∶21.32±0.18 1∶1∶2

通过 (表1)看出随着生物活性玻璃的增加，支架的压缩强度大大提高，孔隙率下降缓慢，样本4显示样本压缩强度提高了120%左右，但孔隙率才下降3%，未低于85%符合组织工程对支架的孔隙率基本要求。

2.3 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架材料的DSC热分析检测结果

本支架在45℃之前没有丢失，证明本支架在人体正常体温无质量丢失，如图3。

2.4 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架表面性能分析

生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架X射线衍射结果显示在19.2°、26.8°、35.2°可以看到特征性的羟基磷灰石衍射峰，31.7°可看到生物活性玻璃衍射峰，未看见明显的壳聚糖峰。这说明壳聚糖晶态减少，而羟基磷灰石与生物活性玻璃未有减少，晶态成分未改变。

傅立叶变换红外光谱在 1412cm-1、1565cm-1、1630cm-1可见CO32-的吸收峰，在565 cm-1、601cm-1、924 cm-1、1088 cm-1都可见特征的 PO43-吸收峰，这表明材料中壳聚糖与羟基磷灰石都存在，生物活性玻璃未改变壳聚糖与羟基磷灰石的化学结构。这与X射线衍射结果一致，见图4。

图4 BG/HA/CS支架材料傅立叶变换红外光谱

2.5 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架细胞增殖实验

采用细胞增殖实验测量骨髓间充质干细胞在生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架上的增殖情况，对照组选用羟基磷灰石/壳聚糖支架，结果见图5。骨髓间充质干细胞在生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架上比在羟基磷灰石/壳聚糖支架上增殖更明显，表现出更出色的细胞相容性。两组之间差异有显著性意义 (P＜0.05)。

图5 BG/HA/CS支架材料与对照组细胞增殖实验

2.6 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架与骨髓间充质干细胞共培养后倒置显微镜下观察

共培养后培养液澄清，复合支架材料表面可见细胞生长。培养液中未见羟基磷灰石及生物活性玻璃颗粒游离，共培养7天内支架大体形态未发生明显改变。

2.7 生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架与骨髓间充质干细胞共培养后扫描电镜观察

共培养5天后，细胞在支架表面粘附，团聚，细胞表面可见微绒毛，细胞已开始向材料内部迁移。(见图6)

图6 共培养5天电镜图(600×)

3 讨论

羟基磷灰石/壳聚糖作为支架材料已有较多的研究报道[8-10]。两种材料都具有良好的生物相容性，羟基磷灰石还是拥有良好的骨传导性。而壳聚糖是一种天然高分子材料，其降解产物为氨基葡萄糖和CO2，能够被人体完全吸收。并且具有好的抗菌性，可塑性很强，但强度不够。羟基磷灰石/壳聚糖支架做为骨代替材料其断裂强度对于骨组织工程的要求还有一定的差距，为了加强生羟基磷灰石/壳聚糖复合支架断裂强度，我们考虑新加入了 AW 生物活性玻璃来加强羟基磷灰石/壳聚糖支架的断裂强度。

AW 生物活性玻璃 (Bioactive glass,BG：CaO-MgOSiO2-P2O5-CaF2)是一种多相复合材料。具有良好的生物相容性、骨传导性和生物活性。AW玻璃在生理环境下抵抗老化和疲劳性能也非常好，它在模拟体液中承受屈服应力65MPa (相当于人体承受的最大应力)可达10年。此外AW生物活性玻璃和邻近骨的结合强度甚至高于材料本身或骨组织的强度[11-13]。在现有的生物活性玻璃中，其机械性能最佳。

制备 BG/HA/CS复合物基本方法有溶液共混法，原位复合法，电化学沉积法和温和湿纺法，每种方法都有其优缺点。溶液共混法是将材料溶液共混，注入模具，制备成复合材料。方法操作简单，不易破坏材料的化学结构。冷冻干燥法是将溶液快速冷冻，然后在低温降压条件下升华脱水，再通过分解、破碎等工艺制得粉体的方法。在本实验中该方法能够控制其支架的外形并形成多孔结构，且孔径大小合适，而且研究还发现该方法制备过程中HA不会对壳聚糖网络发生影响[14]，也可以避免高温熔融法对生物活性玻璃活性的影响。本研究采用的冷冻干燥技术不需要加入非溶剂，将聚合物溶于溶剂中，降低温度使溶剂在聚合物溶液中结晶，再使溶剂升华或被其他溶剂交换而形成多孔支架。其中水做为可操控的造孔剂被我们使用。生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架的力学性能与孔隙率检测证实生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架中生物活性玻璃的加入可以明显提高支架的压缩强度，表1所见，1∶1∶2比例的BG/HA/CS复合支架压缩强度为1.95MPa，比1∶2比例的HA/CS复合支架的压缩强度0.88MPa上升了120%。虽然BG/HA/CS复合支架孔隙率达到86.96%，比HA/CS复合支架的孔隙率89.70%下降3%，但是BG/HA/CS复合支架孔隙率达到骨代替材料孔隙率85%基本要求。通过上述的理化性能和力学性能的结果，我们通过SPSS 16.0计算得出HA/CS复合支架加入了生物活性玻璃和断裂强度有明显关联性关系，但和孔隙率无明显关联性关系。所有证实HA/CS复合支架加入了生物活性玻璃存在一定的相关性。

通过扫描电镜 (SEM)对生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合材料支架进行观察结果提示：本支架材料具有孔孔贯通的结构，不同的层次也有孔道相连，孔径大小约在100～300um之间。这表明我们通过溶液共混法，冷冻干燥法制备的生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合材料支架在三维结构上完全满足生物支架材料的要求，其中孔径为100～300um的孔道也有利于细胞的生长和增殖。同时扫描电镜观察未见羟基磷灰石晶体聚集，未见生物活性玻璃集聚。这表明羟基磷灰石和生物活性玻璃在复合材料中已充分分散。

红外光谱分析和X射线衍射分析是对材料本体性能检测的基本方法。本研究中，我们通过生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合材料支架红外光谱分析可见特征的PO43-吸收峰，这表明材料中壳聚糖与羟基磷灰石都存在，生物活性玻璃未改变壳聚糖与羟基磷灰石的化学结构。生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合材料支架X射线衍射分析可以看到特征性的羟基磷灰石衍射峰和生物活性玻璃衍射峰，未看见明显的壳聚糖峰。这说明壳聚糖晶态减少，而羟基磷灰石与生物活性玻璃未有减少，晶态成分未改变。这表明我们用溶液共混法，冷冻干燥法制备的材料支架中单一的基质材料并未发生理化特性的改变，并没有发生化学反应形成新的物质。DSC热分析检测结果证明BG/HA/CS复合支架在45℃之前没有质量丢失，表明本支架物质在人体正常体温无质量丢失。符合生物材料的要求。

本实验中通过BMSCs与生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架共培养1天后，倒置相差显微镜观察发现细胞在支架表面粘附,部分细胞伸展，并伸出伪足。共同培养5天后，扫描电镜观察发现，细胞在支架表面粘附，团聚，细胞表面可见微绒毛，细胞已开始向材料内部迁移。MTT检测提示复合支架材料组和对照组随时问延长保持正常的增殖速度，两组之间差异无显著性意义（P＞0.05）。表明了BMSCs细胞可以在本支架上可以黏附、增殖。这表明我们通过溶液共混法及冷冻干燥法制备的生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合支架拥有良好的生物相容性。

综上述得知，我们用溶液共混、冷冻干燥技术制备的生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖支架，具有良好的机械性能和细胞相容性，孔径大小适合，本支架将在骨组织工程修复骨缺损方面将会用广阔的空间。

因本研究只对生物活性玻璃/羟基磷灰石/壳聚糖复合支架进行理化性质，细胞相容性研究，而生物相容性的研究内容较多需进一步实验研究。

[1] Thom son RC, Wake MC, Y aszem sk iM J, et a.l Biogradablepolymer scaffolds to regenerate organs [J]. Advances in po lyme rsSc ience, 1995, 122 : 245-274.

[2] Ishaug Riley SL, Crane GM, Gurlek A, et a.l Ectopic boneformation by marrow strom al osteob last transplanation using poly(DL- lactic-co-g lycolic acid)foam s implan ted into the rat m esentery[J]. J Beam edM a ter Res, 2009, 36 :1-8.

[3] 黄江鸿，王大平，刘建全，等.新型聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨的细胞相容性[J].实用骨科杂志，2012，4(18)：323-326.

[4] 徐小燕，刘涛涛，郑军，等.壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的研究进展[J].材料导报，2012，8：102-106.

[5] 郭恩言，王峰，赵萍，等.纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备及发展趋势[J].中国组织工程研究与临床，2010，14(3)：500-504.

[6] 钱炜，喻爱喜，漆白文，等.碳纳米管/羟基磷灰石/壳聚糖骨修复材料的制备及细胞相容性研究[J].中华显微骨科杂志，2011，(344)：301-304.

[7] Atsushi Matsuda,Toshiyuki Ikoma,Hisatoshi Kobayashi.Preparation and mechanical property of core-shell type chitosan/calcium phosphate composite fiber[J].Materials science and Engineering, 2009,24:723-728.

[8] 许勇，朱立新，田京，等.纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，8：1423-1427.

[9] 徐挺，何狄，周银银，等．羟基磷灰石/壳聚糖生物复合材料的制备研究进展[J]．生物骨科材料与临床研究，2008，2(5)：44.

[10]王新．纳米羟基磷灰石—壳聚糖骨组织工程支架的研究[D]．北京：中国协和医科大学，2007.

[11]Vande PJ,Matthew HT,Desilva SP,et al.Oral polio vaccine influences the immune response to BCG vaccination[J].J Biomed Mater Res.2010,59(2):585-590.

[12]Hench LL,Polakand JM.Third-generation biomaterials[J].Science 2002,29(5):1014-1017.

[13]Lai J,Garino P.Silicon excretion from bioactive glass implanted in rabbit bone[J].Biomaterials,2010,17(23):213-217

[14]孙珍珍，蔡汝汝，蒲曦鸣，等.壳聚糖/羟基磷灰石复合骨折内固定棒材的制备与性能研究[J].功能材料，2011，42(1)：128-131.

The research about preparation process and cell compatibility of Bioactive Glass/Hydroxyapatite/Chitason bone repairmaterials

ObjectiveBased on bone tissue engineering's theory,we designed a kind of bone tissue scaffold which is made of the composite material of bioactive glasses(BG)and hydroxylapatite(HA)and chitosan(CS),and detected the bone tissue scaffold's physical and chemical properties in order to estimate the scaffold's clinical applying feasibility forbone graft.MethodsDifferent proportions of BG/HA/CS mixture was prepared into scaffolds by freeze-drying method. By scanning electron microscope,X-ray diffraction and Fourier infrared spectral analysis,DSC thermal analysis,its microstructure and composition,Calculate the stents'porosity,Adopt material testing machine of mechanical properties test.Inoculate the third-generation rabbit mesenchymal stem cells into the stents and use electron microscopy scanning the adherency of stents.Detect the proliferation of cells which are adhere to the stents.Evaluate the compatibility of the stents and cells.ResultsSynthetic BG/HA/CS scaffold has the same size and geometric configuration and has the same porous interconnected structure with matrix,has no hydroxyapatite crystal aggregation and carbon nano tube rally,and has high poriness(average to 86.96%)with appropriate pore size(100 to 300um),and compression strength of the scaffold is(1.55±0.13)Mpa.Characteristic BG and characteristic HA diffraction peak can be seen through X-Ray diffractionfigure technology. The absorption peaks of BG and characteristic PO43-can be detected through Fourier TransformInfrared Spectroscopy.which indicated there was obvious HA crystical in the composite scaffold. the 3rd class rabbit Bonemesenchymal stem cells cultivated in SyntheticBG/HA/CS scaffold after one day, cellsadh-ered to the surface of the scaffold andsome cells stretched pseudopod. After fivedays,more and more cells reproduced and gathered and migrated into interior of the scaff-old,microvillus could be seen in the cells.BMSCs propagation was tested with MTT ways,which showed BMSCs could reproduce obviously in BG/ HA/CS scaffold.ConclusionThe BG/CS/HA stents can be preparate through the solution blending and freeze drying technology.The stents has good porosity,high mechanical strength and good compatibility with cells.It can be used for organization of bone tissue engineering.

BG;HA;CS;Tissue engineering;Bone

R318.08

A

成昊(1982-)男，硕士研究生，医师。工作方向：创伤骨科。

*[通讯作者]祝少博(1970-)男，博士，主任医师。工作方向：创伤骨科。

2013-12-30)

湖北省教育厅科研计划项目(B20122415)；湖北省自然科学基金项目(2012FFB02002)

1武汉大学中南医院骨科，湖北武汉430071；2湖北科技学院外科教研室，湖北咸宁437100；3湖北医药学院附属十堰市人民医院骨科，湖北十堰442000