蒽酮-硫酸分光光度法测定五味子中总多糖含量

徐小娜，鲁 岐，宋凤瑞，黄海龙

(1.南华大学，湖南 衡阳421001；2.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连 116600；3.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春130022)



蒽酮-硫酸分光光度法测定五味子中总多糖含量

徐小娜1，鲁 岐2，宋凤瑞3*，黄海龙1

(1.南华大学，湖南 衡阳421001；2.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连 116600；3.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春130022)

通过单因素实验选择和正交设计对五味子中多糖进行超声辅助提取，以吸光度值为指标，分别对料液比、提取温度、提取时间和提取次数等因素进行考察，优化出超声辅助提取五味子多糖的最佳条件为料液比1∶30、提取时间40min、温度60℃、提取次数为1次。在优化的条件下对湖北和辽宁产的五味子中总多糖含量进行测定，得出北五味子总多糖含量为39.31mg/g，南五味子总多糖含量为24.05mg/g，二者多糖含量存在显著性差异。

五味子；蒽酮-硫酸；多糖；含量测定

五味子(Schisandrachinesis(Turcz).Bail)为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，味酸、性甘温，具有收敛固涩、生津止渴、宁心安神、兴奋呼吸、调节血压、增强视力及改善智力等多种功效[1]。其主要成分为挥发油、木脂素、多糖等[2,3]。多糖是五味子重要的活性成分，具有补肾养心、增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗肝炎、调血脂、降血糖、抗衰老等多方面的药理作用[4-6]。

本实验采用超声波辅助提取技术，以吸光度值为考察指标，在单因素实验的基础上，通过正交实验对五味子多糖的提取工艺进行优化，并利用蒽酮—硫酸分光光度法测定[8]五味子中总多糖含量，为五味子多糖的深入研究提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙醇、浓硫酸、葡萄糖均为分析级，蒽酮(上海隆垒生物科技有限公司)，五味子药材信息见表1。

岛津UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，KQ-2200DE 型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，800B 型离心机(上海安亭科学仪器厂)，101-2 型电热恒温鼓风干燥箱(北京科威仪器有限公司)。

表1 五味子药材信息

1.2 实验方法

1.2.1 硫酸-蒽酮溶液制备 精密称取蒽酮0.1g，用80%硫酸溶液溶解，配成100mL溶液，备用。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取无水葡萄糖10mg，加入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得0.1mg/mL的葡萄糖对照样品溶液。

1.2.3 样品制备 精密称取五味子粉末0.2g于10mL比色管中，加入6mL 60%乙醇溶液作为提取剂，60℃下超声波辅助提取40min，提取1次，过滤，收集滤液，再加80% 乙醇去脂肪，静置沉淀后，将上层悬浮物离心(4 000r/min，30min)，取出，合并沉淀，将沉淀溶于丙酮中充分洗涤静置过夜，沉淀再次用无水乙醇充分洗涤后，静置，待沉淀完全后将沉淀物置于旋转蒸发仪中加热至一定体积，经真空干燥得到五味子粗多糖，用蒸馏水溶解定容至5mL，保存于4℃冰箱，备用。

1.2.4 标准曲线绘制 精密称取无水葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容后摇匀，得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖对照液。精密吸取对照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分别置于10mL具塞试管中，加蒸馏水至2.0mL使之溶解，分别加入蒽酮—硫酸储备液6.0mL，并于热水浴中加热，10min后取出置于冰水浴中冷却，10min后取出，以试剂空白为参比，于620nm处测定吸光度。以吸光度A与对应浓度C作图，得回归方程为A=0.5739C+0.2248，线性范围为2.5～15.0μg/mL，相关系数R=0.9987。

1.2.5 多糖含量测定 采用蒽酮-硫酸法测定多糖的含量。分别吸取样品溶液适量，按“1.2.4”方法测定，并按下式计算多糖含量：多糖含量(mg/mL)=(C×Df/m)×100%。其中，C表示供试溶液中葡萄糖的含量(mg/ mL) ；D为供试溶液的稀释倍数，f为换算因子；m代表样品质量(mg)。

2 结果与讨论

2.1 五味子多糖提取条件的优化

2.1.1 单因素实验

(1)提取溶剂的选择：分别用水、甲醇、乙醇处理样品，测定所获溶液的吸光度值，如图1所示。在甲醇、乙醇和水三种溶剂中，用乙醇做提取溶剂获得的吸光度值最大，实验确定提取溶剂为乙醇。

(2)乙醇浓度的影响：试验30%、40%、50%、60%和70%五个乙醇浓度对样品吸光度的影响(如图2)，结果表明用60%乙醇浓度做提取剂获得的吸光度值最大，实验确定乙醇浓度为60%。

图1 不同提取溶剂所得吸光度值

图2 乙醇浓度对吸光度的影响

(3)料液比的选择：试验1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35五个不同的料液比处理样品，测定吸光度值，所得结果如图3所示。随着料液比的增加，吸光度值呈现先升高后降低趋势，当料液比(m/V) 为1∶30 时，吸光度值最大，当料液比继续增加时，吸光度值下降，故选料液比(m/V)为1∶30(g/mL)。

图3 不同料液比的吸光度值

(4)提取时间的选择：在样品的提取时间分别为30、40、50、60、70min的情况下测定吸光度值，结果如图4所示。当提取时间为40min时，样品的吸光度值最大，实验确定样品提取时间为40min。

图4 不同提取时间所得吸光度值

(5)提取次数的确定：选择单因素实验中的最佳料液比为1∶30(60%的乙醇溶液)、提取温度为60℃、提取时间为40min，试验不同提取次数对五味子多糖的影响。当提取次数由1次、2次增加到3次时，吸光度值都有所增加，但增加程度不大，从节约试剂和提高实验效率等因素考虑，选择超声提取1次。

2.1.2 正交实验 在单因素实验的基础上采用正交实验设计，因素、水平及结果见表1。在各因素中，温度对测定结果的影响最大，其次是时间和料液比。最佳提取条件为：提取时间40min，温度60℃，料液比1∶30。

表2 L9(33)正交试验方案及实验结果

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验 精密量取葡萄糖对照品溶液0.5mL于10mL具塞比色管中，按照标准曲线项下自“再分别加入蒽酮-硫酸储备液0.6mL”起操作，所得结果的RSD为0.35%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.2.2 重复性实验 取同一批五味子样品3 份，分别按“1.2 实验方法”制备多糖溶液，测定多糖含量，RSD为0.39%(n=3)，表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性实验 取0.1mg/mL葡萄糖溶液0.6mL于10mL具塞比色管中，按照标准曲线项目下自“再分别加入蒽酮-硫酸储备液0.6mL”起操作，测定0、10、20、30、40、50、60、90、120、150min的吸光度值，发现随着时间的延长，吸光度值逐渐减小，因此选择在20min内完成测定。

2.2.4 回收率实验 分别精密制备3份样品溶液0.2mL置于10mL具塞比色管中，依次添加0.1mg/mL葡萄糖溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL，并加入水使终体积为1.0mL，空白对照为水1.0mL，按照标准曲线中“再分别加入蒽酮-硫酸储备液0.6mL”起操作测定含量，每份样品做3次平行测定，计算回收率。结果发现，回收率为98.13%～107.97%，RSD小于5%，表明该方法的准确度较高。

2.3 五味子多糖含量测定结果

七个不同来源的五味子药材分别按“1.2”项下方法制备多糖溶液，按“1.2.3”项下自“再分别加入蒽酮-硫酸储备液0.6mL”起操作、测定。所得结果见表3。

3 结语

本实验采用超声波辅助提取技术，通过单因素实验选择对五味子中多糖进行超声提取，以五味子中的多糖提取率为指标，分别考察了料液比、提取温度和提取次数等因素对提取率的影响，通过正交设计法对超声波提取法提取五味子多糖的最佳条件进行了优化，最终得出：料液比(m/V)为1∶30、提取温度为60℃、提取时间为40min、提取次数为1次。

表3 五味子多糖含量测定结果 (n=3)

注：此表中序号与表1中序号相对应。

研究中测定了南北五味子及其五个商品药材的总多糖，北五味子总多糖含量为39.31mg/g，南五味子总多糖含量为24.05mg/g。北五味子总多糖的含量较南五味子高，存在显著性差异。五个商品药材总多糖的含量处于12.38～28.51mg/g之间。发现将优化的实验条件应用于实际样品的测定，结果令人满意，所得结果可为五味子多糖的深入研究提供参考。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 [M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:169.

[2] LOU ZY, ZHANG H, GONG C, et al. Analysis of lignans in Schisandra chinensis and rat plasma by high-performance liquid chromatography diode-array detection, time-of-flight mass spectrometry and quadrupole ion trap mass spectrometry[J].Rapid communications in mass spectrometry, 2009, 23(6): 831-842.

[3] WANG BL, HU JP, TAN W, et al. Simultaneous quantification of four active schisandra lignans from a traditional Chinese medicine Schisandra chinensis(Wuweizi) in rat plasma using liquid chromatography/mass spectrometry[J].Journal of chromatography B, 2008, 865(1-2): 114-120.

[4] 汪艳群,孟宪军,刘丽,等.五味子废渣中多糖的分离及体外抗氧化活性[J].食品与生物技术学报, 2013,32(2): 163-168.

[5] 陈雯, 刘宝瑞.五味子多糖的抗肿瘤研究进展[J].中医临床研究,2012,4(14):24-25.

[6] 王春梅,李贺,陈建光.北五味子多糖对高脂血症大鼠血管内皮功能的影响[J].中药药理与临床,2013, 29(3):100-103.

[7] 袁菊丽.超声提取杜仲多糖的工艺优化[J].应用化工,2011,40(5):817-818.

[8] 任丽佳,黄玮,殷放宙,等.五味子炮制前后总多糖的分析比较[J].南京中医药大学学报,2012,28(1):86-88.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Total Polysaccharide in Schisandra Chinensis Turcz.Bail by Anthrone-sulfuric Acid Spectrophotometric Method

Xu Xiaona1, Lu Qi2, Song Fengrui3*, Huang Hailong1

(1.School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001,China; 2.Dalian Fusheng natural drug development Co. Ltd., Dalian 116600,China; 3.Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022,China)

In this study, single factor and orthogonal design was used for ultrasonic assisted extraction of polysaccharide from Schisandra chinensis Turcz. Bail．Based on absorbance value, the solid-liquid ratio, extraction temperature, extraction time and extraction frequencies and other factors were investigated. The best conditions for the ultrasonic method to extract polysaccharide were as follows: solid-liquid ratio( m/V) was 1g∶ 30mL, extraction temperature was set at 60℃, extraction time was 40min, extracting for 1 time. Under this condition, the polysaccharide of Schisandra chinensis Turcz. Bail. from Hubei and Liaoning province were respectively detected. The results obtained show there are significant differences between the tested samples on the content of polysaccharide.

Schisandra Chinensis Turcz. Bail；Anthrone-sulfuric Acid；Polysaccharide

2014-03-20

国家自然科学基金项目(11205085)；湖南省教育厅项目(12C0334)；衡阳市科技局项目(2013KJ14，2013KJ15)

徐小娜(1974-)，女，南华大学公共卫生学院讲师，研究方向为中药化学成分分析、中药指纹图谱技术。

宋凤瑞(1962-)，女，中国科学院长春应用化学研究所研究员、博士生导师，研究方向为中药质量控制。

R282.5

A

1673-2197(2014)15-0015-03