维药PCR技术探析

靳 剑，张 新

(1. 乌鲁木齐市中医医院 药学部，新疆 乌鲁木齐 830000；2.乌鲁木齐市烧伤医院 药剂科，新疆 乌鲁木齐 830000)



维药PCR技术探析

靳 剑1，张 新2

(1. 乌鲁木齐市中医医院 药学部，新疆 乌鲁木齐 830000；2.乌鲁木齐市烧伤医院 药剂科，新疆 乌鲁木齐 830000)

目的：根据PCR聚合酶链反应，采用分子生物技术探析维药在PCR方面的技术应用。方法：采用高温低pH法，防止组织被破坏及其它物质的氧化，提取高纯度DNA，直接用于随机扩增多态性DNA(PADA)等分子水平遗传标记PCR 扩增反应。结果：大部分维药可获得总的DNA提取，无扩增产物出现。结论：PCR技术鉴定维药具有快速、简捷、方便、有效的特点。

维药；高温低pH；PCR

PCR为聚合酶链反应，原理为通过利用分子生物引物，将原痕迹量DNA扩增到足以进行检测与分析的数量，具有高速、高效、优质和全部自动化的优点[1-3]。随着科学技术的不断深化和发展，制定新的快速、有效、简捷、专属性强的现代化检测方法势在必行。维药作为民族医药有着举足轻重的地位，目前维药还没有比较规范的整套鉴定方法[4]。PCR扩增的模板DNA作为遗传信息载体，不受外界因素、生物发育阶段及器官组织差异等影响，具有高速、高效和高特异性等特点[5]。从分子生物学的角度检测药品更能确保其质量可靠，现简单探析维药的PCR技术工艺,具体报道如下。

1 材料与试剂

1.1 维药种类

1.1.1 菊科 5种菊科维药的名称、来源、拉丁名见表1。

表1 5种菊科维药

1.1.2 豆科 10种豆科维药的名称、来源、拉丁名见表2。

1.1.3 伞形科 9种伞形科维药的名称、来源、拉丁名见表3。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 低温高速离心机(上海医用分析仪器厂)，恒温水浴箱，恒温摇床，冰箱，电子天平，DYCP-31B型电泳，PCR仪(MJ Research PTC-100TM，Programmable Thermal ,USA)，DYY-稳压电泳仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像仪。

表2 10种豆科维药

1.2.2 试剂 SDS(十二烷基硫酸钠)，EDTA(乙二胺四乙酸)，β-硫基乙醇，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，氯仿，醋酸钠，醋酸钾，异戊醇，异丙醇，琼脂糖，1×TBE溶液，溴乙锭，二甲基苯青，其它溶剂均为国产分析纯。

1.4 植物药前处理

1.4.1 高温低pH法 该法提取的药品DNA纯度较高，主要原理为：利用低pH提取介质，可有效防止组织被破坏、材料沉淀时的电离作用及酚化物氧化。所提取DNA纯度较高，无需进一步纯化，可直接用于随机扩增多态性DNA(RADP)等分子水平标记。采用低pH介质高盐沉淀蛋白方法，可从新鲜材料或干品植物材料中提取得到总DNA。

表3 9种伞形科维药

1.4.2 方法 市售干品药材粉碎，过60目筛，采用去离子水清洗，紫外线照射30min，取粉末0.3g,置研钵中，加1.0g玻璃沙研磨至极细粉末。加入预热(50℃)的缓冲液A(100mmol·L-1醋酸钠，50mmol·L-1EDTA,500mmol·L-1NaCl,2.5%PVP，3%SDS,1%β-巯基乙醇，pH为5.5)于研钵中混匀，取10mL于离心管中，置恒温床(56℃)温育30min，于转速10 000r/min离心10min。取上清液至另一离心管中，加2/3倍体积2.5M(pH为4.8)醋酸钾洗液置于4℃冰箱保存30min，于转速10 000r/min离心10min；转移上清液移至另一离心管中，加等体积氯仿-异戊醇混匀，4℃、10 000r/min离心15min重复1次；上清液加2/3体积冷异戊醇(-20℃)混匀置-20℃冰箱30min。于4℃、10 000r/min离心20min，吸取上清液采用70%乙醇沉淀2次，洗去乙醇，倒置试管于吸水纸上，于无菌台吹风机吹干，加入ET洗液300～400μL,4℃保存备用。

2 结果

2.1 DNA检测

检测已提取的植物总DNA，采用琼脂糖电泳方法：置于1%的琼脂凝胶，加示踪剂(溴酚蓝和二甲基苯青)电泳30min，完毕，凝胶成像仪中观察。

2.2 PCR扩增反应

反应总体积为 30μL，成分：2×TBE缓冲液15μL，牛血清蛋白(BSA)1.5μL，2个引物各2μL,ddH2O 9.5μL，模板DNA(植物基因DNA)2μL。程序：94℃变性，36℃退火35s，72℃延伸70s，2个循环，94℃变性，36℃退火35s，72℃延伸70s，42个循环共44个循环[1]；94℃预变性，180s；94℃，60s；39℃，45s；72℃，60s；35个循环最后72℃，180s。

取上述反应液10μL检测，置1.6%的琼脂糖凝胶上，加示踪染料，采用10×TBE的电极缓冲液30min，完毕，在凝胶成像仪中成像。

2.3 无产物出现原因

循环温度、解链温度不够确切，或者PCR仪指示温度与实际温度不符；引物组成不合理；聚合酶活性发生异常；植物来源DNA较难去除多糖、多酶等物质，可能抑制PCR反应。

3 讨论

本实验所用维药均为维吾尔医院所提供的干品药材，大都能提取总DNA，说明PCR技术具有应用广泛的特点；对提取出来的二十三味药进行PCR 扩增反应，无扩增谱带出现，可看见引物聚合点。提示PCR技术在种类与质量方面的研究，可为维药提供更快、更简捷、更有效的鉴定方法[6]。

本实验准备较为充分，但是由于受实验条件的限制，致使实验结果并不理想。药材总DNA提取较好，但在DNA片段扩增时，引物的选用尚处于初步摸索阶段，同时由于时间有限，致使最终的结果并不理想。多次实验仅能看到引物聚合点，而无扩增片段出现。因此，实验方法、引物的选用及扩增程序还需进一步摸索与改进。

[1] 王培训,周联,赖小平.分子生物学技术与中药鉴[M].广州：广东世界图书出版公司,2002： 92-112.

[2] 刘勇民,沙吾提·伊克木.维吾尔药志[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社,1985.

[3] 肖树雄,林伟忠.中药现代检验新技术[M].广州：羊城晚报出版社，2003：137-183.

[4] 中药大辞典编写组.中药大辞典(上、下册)[M].上海：上海科学技术出版社，1975.

[5] 吴平,周亚平.用聚合酶链产物直接测序技术鉴定中药鳖甲[J].中国药科大学学报, 1982,29(1)：17-21.

[6] 徐朝晖,涂为,杨松松.RAPDF法结合TLC鉴别中药牛蒡子及其混淆品[J].中草药,2000，3(6)：45-46.

(责任编辑：李岚春)

2014-04-29

靳剑(1982-)，男，乌鲁木齐市中医医院药学部药师，研究方向为维药现代化研究。

R291.5

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1673-2197(2014)16-0014-02