液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中赭曲霉毒素A

侯建波，谢 文，李 杰，沈炜锋，何建敏

（1.浙江出入境检验检疫局技术中心，浙江 杭州 310016；2.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；3.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州 310016）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由生长在粮食、花生、蔬菜、水果等农作物上的曲霉属和青霉属产生的一种有毒代谢产物。由于其具有很高的化学稳定性和热稳定性且对多种动物具有潜在的肾毒性、神经毒性和免疫毒性等特性，并与巴尔干地方性肾病（Balkan endemic nephropathy，BEN）有着密切的关系，因此，国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）将其定义为II 2B类致癌物[1]。

由于从葡萄酒中摄取到的OTA占到总摄取量的13%，因此OTA在葡萄酒中的污染情况日益受到人们的关注[2]。欧盟（European Union，EU）和国际葡萄与葡萄酒局（international organization of vine and wine，OIV）等国际组织规定葡萄酒中OTA的最大限量为2μg/L[3]，意大利和保加利亚规定啤酒中OTA含量不得超过0.2μg/L，保加利亚还规定葡萄汁中OTA含量不得超过3μg/L[4]。我国虽然尚未对葡萄酒中赭曲霉毒素A的残留量进行明确规定，但已明确要求谷物、豆类及其制品中OTA的最大限量为5.0μg/kg[5]，饲料中OTA允许量≤100μg/kg[6]。为降低葡萄酒中赭曲霉毒素A的残留，国际食品法典委员会（codex alimentarius commission，CAC）已经制定预防和降低葡萄酒中赭曲霉毒素A污染的操作规范[7]。

目前对于葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定主要以高效液相色谱法[8-10]、酶联免疫法[11-12]和液相色谱-质谱/质谱法为主[13-15]。在前处理净化方式上，美国分析化学家协会（association of official analytical chemists，AOAC）采用免疫亲和柱（immunoaffinity chromatography，IAC）进行净化[8]，该法被OIV等国际组织所采用，但由于免疫亲和柱成本过高，因此研究人员陆续研发采用HLB、C18等固相萃取柱的净化方式[15-17]。赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素A在化学结构上仅相差一个氯原子，理化性质接近，且已有研究表明赭曲霉毒素B的产生几率和毒性均较低[18]，因此本研究以赭曲霉毒素B为内标物，采用液相色谱-串联质谱法对葡萄酒中OTA的残留量进行测定。方法操作简便，适用性强，测定低限满足目前国内外对其限量的要求。可为提高葡萄酒质量安全，对葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的检测提供有效的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C18固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）（500mg，3mL）：德国CNW科技公司；OasisHLBSPE柱（500mg，6mL）：美国Waters公司；MAX SPE柱（150mg，6mL）：美国Waters公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）：美国Tedia公司；乙酸铵（分析纯）：中国国药集团；赭曲霉毒素A（纯度＞98%）：美国Enzo Life Sciences公司；赭曲霉毒素B（质量浓度10.1μg/mL）：英国LGC标准品公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260-6490型液相色谱-串联质谱仪：美国安捷伦公司；HERAEUS Multifuge X1R型台式离心机：美国Thermo公司；Milli-Q Gradient型超纯水净化系统：美国Millipore公司；VISIPREPTM DL型固相萃取装置：美国SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理方法

准确移取5mL葡萄酒，加入赭曲霉毒素B内标物20ng，用5%的氨水调节pH=7.0±0.3，8 500r/min离心5min，上清液转移至C18固相萃取净化柱（3mL甲醇和3mL水进行活化），加入5mL水进行淋洗，减压抽干，加入5mL甲醇进行洗脱，洗脱液氮吹至近干，用甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后待测定。

1.3.2 仪器测试方法

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）。流动相：甲醇/0.15%甲酸水溶（含5mmol/L乙酸铵）=7∶3（V/V），等度洗脱；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。离子源参数：干燥气温度250℃，干燥气流速16L/min，雾化气压力0.005 6Pa，鞘气温度：350℃，鞘气流速10L/min，毛细管电压3 500V。

2 结果与分析

2.1 净化条件的选择

实验发现葡萄酒自身pH值3.5～4.5，分别考察不同pH值[葡萄酒自身pH值和pH=5.0±0.3，7.0±0.3（仅MAX SPE柱）和9.0±0.3（仅MAX SPE柱）]下OTA在C18、HLB和MAX 3种类型SPE柱的色谱行为。结果表明，pH值对OTA的净化效果影响不大，MAX SPE柱净化谱图背景效果最好，其净化需要的洗脱液体积最大，且回收率较C18和HLB SPE柱约低10%。综合考虑净化操作的简易程度和实验成本等因素，最终选择C18SPE柱在pH=7.0条件下进行净化。

2.2 色谱条件的选择

以Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）和Agilent Eclipse XDB-C8（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱为基础，对色谱分离流动相[乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）]和定容溶液[乙腈，甲醇，乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）]展开正交试验。结果表明，酸性环境的流动相可明显改善谱峰形状，乙酸铵可明显提高谱峰强度（甲醇为流动相），综合对比谱峰的峰形、响应强度以及分离效果，最终选择C18色谱柱，甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）为定容溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸铵）7∶3（V/V）为液相色谱分离体系。

2.3 质谱条件的选择

采用流动注射的方式在正和负离子模式下对待测化合物的标准溶液分别进行稀释和母离子全扫描，确定分子离子峰，再以分子离子峰为母离子对其子离子进行全扫描。结果显示，OTA的[M-H]-的信号响应最低，其[M+H]+（质荷比404.2）和[M+Na]+（质荷比426.1）获得的碎片离子如图1所示。综合考虑信号响应强度和离子稳定性，选择[M+H]+及其子离子进行测试。按照欧盟EC/657指令的要求，选择404.2/239.1和404.2/358.0为两个特征子离子，其中404.2/239.1信噪比高、峰形好、干扰小作为定量离子对，OTB内标物离子对为370.2/205.2。

2.4 方法学考察

2.4.1 基质效应

液相色谱-串联质谱法测定药物残留时，有时基质对离子对具有增强或抑制效应。本研究在不含待测目标化合物的空白葡萄酒中添加OTA的标准物质（添加质量浓度2.0μg/L），外表法定量，以抑制率[（葡萄酒基质中OTA离子对的响应强度-溶剂中OTA离子对的响应强度）/溶剂中OTA离子对的响应强度×100%]来考察基质效应情况。计算结果显示基质抑制率约13%，最终实验采用葡萄酒空白提取液作为标准溶液的稀释溶液，可使标准溶液和样品溶液具有同样的离子化条件，从而克服样品基质效应，结合OTB内标法消除操作过程中的系统误差，更好地保证测定结果的准确性。

图1 赭曲霉毒素A([M+H]+和[M+Na]+)和赭曲霉毒素B(M+H]+)的离子全扫描质谱图Fig.1 Full scan ion spectrogram of ochratoxin A and ochratoxin B

2.4.2 方法的线性关系、定量限和方法精密度

在确定的实验条件下展开测试，测定各化合物的谱峰面积，以质量浓度x（μg/L）为横坐标，以OTA与OTB的峰面积比值y为纵坐标，绘制OTA标准工作曲线，OTA的溶液质量浓度分别为0、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、50ng/mL（OTB内标物溶液质量浓度20ng/mL）；OTA的相应质量浓度分别为0、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、10.0μg/L。OTA标准曲线的线性回归方程：y=0.141x+0.002 63，相关系数0.998 5。在OTA含量为2.0μg/L时，信噪比约384＞10，即该方法满足欧盟和OIV设定的OTA定量限要求，可进行准确定量OTA。

选用不含待测组分的空白葡萄酒，分别添加OTA标准溶液，添加质量浓度分别均为2.0μg/L、4.0μg/L和8.0μg/L，实验结果如表1所示。由表1可知，赭曲霉毒素A回收率范围97.6%～109.7%，相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）3.0%～4.6%。葡萄酒中OTA标准溶液的LC-MS/MS测试选择离子流图如图2所示。

表1 葡萄酒中赭曲霉毒素A的回收率及精密度Table 1 Recovery rate and precision of ochratoxin A in wine sample

图2 不同条件下赭曲霉毒素A的选择性离子流图Fig.2 Selected ion chromatograms of ochratoxin A in different conditions

3 结论

本研究通过C18固相萃取净化，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），在正离子多反应监测模式下对葡萄酒中赭曲霉毒素A进行测定。以赭曲霉毒素B为内标物进行定量计算，方法定量限2.0μg/L。在0～10μg/L质量浓度范围内线性相关系数R＞0.998。回收率范围97.6%～109.7%，相对标准偏差RSD 3.0%～4.6%，该方法简便快速，准确度高，精密度好。满足欧盟和OIV等国际机构对葡萄酒中OTA的限量法规要求，可用于葡萄酒中赭曲霉毒素A的定量测定。

[1]International agency for research on cancer.Some naturally occurring substances:food items and constituents,heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[C].IARC working group on the evaluation of carcinogenic risks to humans,Lyon,1993.

[2]Joint FAO/WHO food standards programme codex committee on food additives and contaminants.thirty-eighth session[C].The Hague,the Netherlands,24-28 April 2006.

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