酿酒葡萄渣粕原花青素提取工艺研究

亓 伟，张亓伊雯，格日勒*

（1.银川能源学院 石油化工学院，宁夏 银川 750011；2.山东大学 数学学院，山东 济南 250100）

原花青素素（proanthocyanidins，PC）是植物核、皮及种子中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，研究表明，原花青素的抗氧化特性极强，具有降血脂、降血压、促进骨形成等作用[1]。PC拥有强有力的抗氧化能力，其在人体内氧化后清除自由基的能力是VC的20倍[2-3]，VE的50倍。在营养保健、化妆品、食品、医药等领域的应用越来越广泛。使得这一安全、高效、无毒的天然抗氧化剂日益受到关注和重视[4]。原花青素是生物类黄酮类络合物，是纯天然抗氧化剂和高效的自由基清除，具有改善心脑血管功能、降血压、降血脂、抗过敏等多方面的功能[5]，同时原花青素还是高效的紫外线吸收剂，在化妆品中作为防晒剂也大量应用，主要面向日本、韩国、欧美等发达国家出口[6-8]。

宁夏银川贺兰山东麓具有合适的气候、土壤、光照、降水等得天独厚的条件，自治区政府高度重视葡萄产业的发展，将葡萄产业确定为宁夏农业发展的优势特色产业，到2015年预计酿酒葡萄生产近466.6km2，年产酿酒葡萄约31万t，成为宁夏多家葡萄酒厂和已经批准待建的16家酒庄的酿酒原料，这些葡萄酿酒后产生了大量的渣粕（主要是葡萄籽及葡萄皮），约占葡萄加工量的15%～20%，大多渣粕被当作肥料、饲料甚至被废弃处理，不仅浪费资源，而且污染环境。宁夏唐明制药有限公司拥有先进的超临界萃取装置，现主要用于对葡萄籽进行提油加工，但提完葡萄籽油之后还会有大量的的萃余物现还未进行有效处理。以宁夏酿酒葡萄渣粕为原料，采用溶剂回流提取法，对酿酒葡萄渣粕中所含有的原花青素进行提取。在单因素试验的基础上，采用正交试验方案，以原花青素提取得率和含量为综合考察指标，对酿酒葡萄渣粕原花青素的回流提取工艺进行优选，得出了酿酒葡萄渣粕原花青素溶剂回流提取的最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒葡萄渣粕：宁夏西夏王葡萄酒厂。

原花青素标准品（批号：MUST-12032802）：成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、香草醛、盐酸（均为分析纯）：安徽安特生物化学有限公司。

1.2 仪器与设备

FK-B型多用植物粉碎机：南京以马内利仪器设备有限公司；UV1800型紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；AG204型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；HH型恒温水浴锅：江苏金坛市中大仪器厂；As3120超声清洗机：北京华博远科技这制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原花青素的提取

精密称取粉碎并过60目筛的酿酒葡萄渣粕10g，加石油醚（沸程30～60℃）回流提取30min，弃去石油醚，蒸干残渣，分别用水、无水乙醇、一定体积分数的乙醇、甲醇、丙酮为溶剂进行浸提，选择合适的提取溶媒，再确定所选溶媒的体积分数，研究提取温度、提取时间、料液比、提取次数等因素对原花青素提取效果的影响，将每次试验得到的提取液过滤，浓缩并干燥至质量恒定，准确称其质量，计算得率[9]，并测定原花青素含量。

1.3.2 原花青素含量的测定

（1）标准储备液配制

准确称取干燥至质量恒定的原花青素对照品0.050 4g置于50mL棕色容量瓶中，加入甲醇30mL，超声溶解，加甲醇定容，摇匀，即得质量浓度为1.008 0mg/mL原花青素标准储备液。

（2）标准溶液配制

取7只10mL棕色容量瓶，精密量称取1.008 0mg/mL原花青素标准储备液0.00、0.500mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL，加甲醇定容，摇匀即得质量浓度分别为0、0.050 4mg/mL、0.100 8mg/mL、0.201 6mg/mL、0.302 4mg/mL、0.403 2mg/mL、0.504 0mg/mL的标准溶液。

（3）标准工作曲线绘制

分别取原花青素标准系列溶液各1mL（另取1mL甲醇液为空白液），分别加入5mL显色剂（0.5%香草醛溶液/4%的盐酸溶液=1∶1（V/V），临用新配），摇匀，避光。在25℃水浴加热25min，保温比色。取出比色管，在波长500nm处，测定其吸光度值，绘制标准曲线[10-12]。

（4）供试品溶液制备

精密称取原花青素粗提物0.201 2g，置于50mL棕色容量瓶中，按标准曲线操作，制得供试品溶液，精密吸取该供试品溶液5.00mL，置于25mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，精密吸取该溶液1.00mL，在波长500nm处，测定其吸光度值，按下式计算原花青素粗提物中原花青素的含量[13]。

式中：D为试样中原花青素的百分含量，%；V为试样定容体积，mL；C为试样中原花青素质量浓度，mg/mL；n为稀释倍数；m为试样质量，g。

2 结果与分析

2.1 原花青素标准曲线的制作

以原花青素标准溶液质量浓度（C）为横坐标，其吸光度值为纵坐标（A），绘制标准曲线见图1。标准曲线回归方程为A=1.397 7C+0.002 1，相关系数R=0.999 6。结果表明，原花青素在50.4～504μg/mL质量浓度范围内具良好的线性关系。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

2.2 提取溶剂的确定

分别选用体积分数为60%的乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、无水乙醇、蒸馏水等提取溶剂在料液比1∶10（g∶mL）、提取时间为60min，提取次数为1次的条件下进行浸提[14-15]，以原花青素得率为考察指标，考察不同溶剂对原花青素提取效果的影响，结果见图2。

图2 不同溶媒原花青素粗提物得率Fig.2 Proanthocyanidins crude extract yield of different solvents

由图2可知，不同溶剂对酿酒葡萄渣粕中原花青素得率有较大差异，丙酮、醋酸乙酯、无水乙醇、蒸馏水的原花青素得率较低，体积分数为60%乙醇、甲醇的原花青素得率较高，考虑到甲醇的毒性较大，所以确定一定体积分数的乙醇为原花青素浸提溶剂。

2.3 不同乙醇体积分数对原花青素得率的影响[16]

分别选用体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，在料液比1∶10（g∶mL），浸提温度80℃，浸提时间60min，提取次数为1次的条件下，以原花青素得率为考察指标，考察乙醇体积分数对原花青素提取效果的影响，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对原花青素粗提物得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on proanthocyanidins crude extracts yield

由图3可知，随着乙醇体积分数的增大，原花青素得率先呈现上升趋势；当乙醇体积分数＞50%时，原花青素得率呈现出下降趋势。体积分数为50%乙醇的原花青素浸提得率最高，故确定最佳乙醇体积分数为50%。

2.4 提取温度对原花青素得率的影响[17]

提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃，在料液比1∶10（g∶mL），体积分数为50%的乙醇作为提取溶剂，浸提时间60min，提取次数为1次的条件下，以原花青素得率为考察指标，考察提取温度对原花青素提取效果的影响，结果见图4。

图4 提取温度对原花青素粗提物得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on proanthocyanidins crude extracts yield

由图4可知，原花青素提取物的得率在50～60℃范围内随温度的升高而升高，60℃时达到最高，60～80℃有所降低，超过80℃则显著下降。因此，确定最佳提取温度为60℃。

2.5 料液比对原花青素粗提物得率的影响[18]

分别以1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30（g∶mL）料液比，在体积分数50%的乙醇作为提取溶剂，提取温度为60℃，提取时间60min，提取次数为1次的条件下，以原花青素得率为考察指标，考察料液比对原花青素提取效果的影响，结果见图5。

图5 料液比对原花青素粗提物得率的影响Fig.5 Effect of liquid solid ratio on proanthocyanidins crude extracts yield

由图5可知，料液比＜1∶8（g∶mL）时，原花青素得率随溶媒量的增加而增大；料液比1∶8（g∶mL）时达到最大；随着溶剂量的继续加大，得率增加趋于平缓，因此，从经济利益考虑，确定最佳料液比为1∶8（g∶mL）。

2.6 提取时间对原花青素粗提物得率的影响

分别以提取时间30min、45min、60min、70min、80min，在体积分数50%的乙醇作为提取溶剂，提取温度为60℃，料液比为1∶8（g∶mL），提取次数为1次的条件下，以原花青素得率为考察指标，考察提取时间对原花青素提取效果的影响，结果见图6。

图6 提取时间对原花青素粗提物得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on proanthocyanidins crude extracts yield

由图6可知，在提取时间＜45min，原花青素粗提物得率随提取时间延长而增加，至60min时达到最大，＞60min后，原花青素得率随浸提时间延长降低。因此，60min为最佳提取时间。

2.7 提取液pH值对原花青素粗提物得率的影响

调节提取液pH值分别为1.0、3.0、5.0、6.2（原液）、7.0、9.0，在体积分数50%的乙醇作为提取溶剂，提取温度为60℃，提取时间为60min，料液比为1∶8（g∶mL），提取次数为1次的条件下，考察pH值对原花青素提取得率的影响，结果见图7。

图7 提取液pH值对原花青素粗提物得率的影响Fig.7 Effect of pH value on proanthocyanidins crude extracts yield

由图7可知，提取液pH值为1.0～5.0时，原花青素得率随pH值增加而增大，pH值＞5.0，原花青素得率有所下降，原液pH值为6.2，得率略低于pH值为5.0的得率，因此，确定提取液pH值为5.0。

2.8 提取次数对原花青素粗提物得率的影响

称取4份酿酒葡萄渣粕，分别加入体积分数50%的乙醇，提取温度为60℃，料液比为1∶8（g∶mL），调节提取液pH 5.0，60℃温度条件下，提取时间60min，分别提取1、2、3、4次，考察提取次数对原花青素粗提物得率的影响，结果见图8。

图8 提取次数对原花青素粗提物得率的影响Fig.8 Effect of extraction times on proanthocyanidins crude extracts yield

由图8可知，提取次数为2次时，原花青素提取得率最大，提取次数为3、4次时，得率没有明显增加，从经济利益考虑，确定提取次数为2次。

2.9 原花青素提取工艺优化正交试验

根据单因素试验结果，提取溶剂的pH值和提取次数对原花青素提取得率影响不明显，因此，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、时间4个因素，以原花青素含量、提取得率作为考察指标（二者权重各占50%）进行4因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表1，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表1 提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction process optimization

表2 提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for extraction process optimization

由表2可知，4个因素对原花青素得率的影响依次为A＞B＞C＞D，即乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。由正交试验得出提取酿酒葡萄渣粕原花青素的最佳提取最佳条件为A2B1C2D1，即乙醇体积分数为50%，提取温60℃，料液比为1∶10（g∶mL），提取时间为45min。在此优化条件下进行验证试验，结果表明，原花青素含量为78.50%，原花青素粗提物得率为15.20%。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可以知，乙醇体积分数及提取温度对结果影响极显著，提取时间对结果影响显著，液料比对结果影响不显著。

3 结论

以酿酒葡萄渣粕为原料，采用乙醇-水溶液提取原花青素，经单因素和正交试验确定了最佳提取工艺条件为乙醇体积分数50%，提取温度60℃，料液比1∶10（g∶mL），提取时间为45min，在此最佳条件下，原花青素含量为78.50%，原花青素粗提物得率为15.20%。

提取酿酒葡萄渣中原花青素，可以大大提高酿酒葡萄渣粕的附加值，而且能带来较大的经济效益和社会效益、为减轻污染提供一条重要的途径。原花青素生物活性广泛，在医药上具有广阔的应用前景，但目前国内外关于原花青素的药品还很少，有待进一步的深入开发。

[1]赵超英，姚小曼.葡萄籽提取物原花青素的营养保健功能[J].中国食品卫生杂志，2000，12（6）：38-41.

[2]DEBASIS B,MANASHI B,SIDNEY J S.Free radical and grape seed proanthocyanidin extract:importanee in human health and disease prevention[J].Toxicology,2000,148(2-3):187-197.

[3]BAGCHI D,GARG A,KROHN R L,et al.Oxygenfree radical scavenging abilities of vitamins C and E,and a grape seed proanthocyanidinsextmetin vitro[J].Res Commun Mol Pathol Pharmacol,1997,95(2):179-189.

[4]赵万洲，陆 茵，闫新琦，等.葡萄籽原花青素抗促癌作用的实验研究[J].中草药，2000，31（12）：917-920.

[5]李 超，王卫东.原花青素提取方法的研究进展[J].粮油加工，2009（9）：145-146.

[6]苏海霞，孔保华，徐 聃.葡萄皮和葡萄子的综合利用[J].农产品加工，2005，47（11）：40-42.

[7]孙传范.原花青素的研究进展[J].食品与机械，2010，26（4）：147-148.

[8]张 迪，赵文军，马丽娟，等.原花青素的性质、功能、纯化和利用[J].安徽农学通报，2009，15（1）：35-49.

[9]李 超，郑 义，王卫东，等.响应曲面法优化亚临界水提取葡萄籽原花青素的工艺研究[J].食品科学，2010，31（1）：7-8.

[10]李春阳，许时婴，王 璋.低浓度香草醛-盐酸法测定葡萄籽和葡萄梗中原花青素含量研究[J].分析检测，2004，25（6）：128-129.

[11]张寒俊，汪海波，习 羽.改进香草醛法测定葡萄提取物中的原花青素[J].中国酿造，2010，29（8）：147-149.

[12]姚 开，何 强，吕远平，等.葡萄籽提取物中原花青素含量不同测定方法比较[J].化学研究与应用，2002，14（2）：230-232.

[13]刘 新，余小平.响应面法优化超声波辅助提取荔枝核中原花青素研究[J].成都医学院学报，2011，6（3）：212.

[14]蔡 晓，杨长晓.紫外分光光度法测定保健食品中原花青素的研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（4）：744-746.

[15]宋应华，陶 冶，张建新，等.脱脂葡萄籽中原花青素提取工艺研究[J].重庆工商大学学报：自然科学版，2010，27（2）：150-151.

[16]施立钦.葡萄籽中原花青素提取工艺研究[J].精细与专用化学品，2007，15（20）：23-26.

[17]赵巧玲.葡萄籽原花青素的提取工艺研究[J].粮食与食品工业，2010，17（3）：33-35.

[18]洪 新，唐 克，赵立松.葡萄籽中原花青素提取条件研究[J].粮油食品科技，2009，l7（4）：74-76.