核桃多肽体外抗氧化活性研究

贾靖霖，陆健康，汪莉莉，王小茹，侯旭杰*

（塔里木大学 生命科学学院 南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

核桃（Julans ragia.）是一种兼具营养价值和经济价值的珍贵果木，同时也是世界上一种非常重要的坚果类果树和木本油料树种[1]。当前，核桃种植面积全球共有228.36万hm2，总产量为256.87万t。据《中国果树志》核桃卷记载[2]，中国种植的核桃面积为66.7万hm2，品种（系）有216个，有2亿多株是实生果树，实生农家品种164个，优良单株系486个，年产量164.91万t，位居世界首位。

新疆盛产核桃，2011年核桃种植总面积（不含兵团）达28.02万hm2，产量达23.42万t，占全国总产量的17.8%，主要分布在阿克苏地区、喀什地区、和田地区，是名符其实的核桃主产区[3]。随着“国家木本油料产业发展战略”的实施、核桃良种化进程的加快、标准化生产技术的推广应用、技术管理和物化投入水平的提高，预计到2015年全疆核桃产量将达到40万t以上[4]。南疆核桃资源丰富、品质优良，主要品种有新丰、扎-343、温-179、新2号、温-185等。其中温-185核桃于1989年通过林业部门鉴定[5]，具有丰产、早熟、抗逆性强、壳薄等特性。随着南疆核桃产业的迅速发展，温-185核桃在南疆核桃产业中的地位将会越来越重要。

目前对温-185核桃的研究主要集中在温185-核桃的丰产栽培技术[6]、核桃壳断口形貌的研究[7]、不同方法制备核桃油的研究[8]等，有关温-185核桃多肽的研究较少。本研究将以前期试验制备的核桃多肽为原料，探讨不同水解度的核桃多肽液的体外抗氧化活性，以期为今后温-185核桃综合利用及开发成各种营养保健食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃薄皮温-185：新疆阿拉尔市禾普商贸城；维生素C、维生素E、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、焦性没食子酸、体积分数95%乙醇、邻菲罗啉、硫酸亚铁、30%双氧水：上海山浦化工有限公司；磷酸二氢钠：天津福晨化学试剂厂；磷酸氢二钠：天津博迪化工股份有限公司；浓盐酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；Tris、二苯代苦味酰自由基：美国Sigma公司；碱性蛋白酶（1×105U/g）、中性蛋白酶（1.3×105U/g）、酸性蛋白酶（5×104U/mg）：上海蓝季科技发展有限公司；化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AR2140电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；88-1磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；211C酸度计：北京哈纳科仪科技有限公司；FD-10-80冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；HHS电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JH756紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃多肽的制备[9]

核桃蛋白的制备采用传统的碱溶酸沉法[2，10]，制备工艺流程如下：

核桃→核桃仁→榨油→核桃粕→体积分数95%乙醇洗涤→过滤→滤饼挥干溶剂→定容→调pH值为9.0→磁力搅拌1h（40℃）→离心（5 000r/min、15min、25℃）→取上清液→调pH值为4.5→磁力搅拌1 h（40℃）→离心（5 000r/min、15min、25℃）→取沉淀→40℃水洗至中性→冷冻干燥→核桃蛋白粉

多酶协同水解核桃蛋白采用分步依次加酶，不同酶解时间制备出2种不同水解度（degree of hydrolysis，DH）的多肽液，其酶解工艺流程如下：

最优条件制得核桃多肽液：称取核桃蛋白粉→定容→调pH值为9.5→加碱性蛋白酶→水浴酶解（5h、50℃）→取出沸水浴10min灭酶活→调pH值为8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（6h、40℃）→取出沸水浴10min灭酶活→调pH值为3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（4h，40℃）→取出沸水浴10min灭酶活→冷却→冷冻离心→取上清液→测定水解度[4]。

最优条件下酶解时间减半制得多肽液：称取核桃蛋白粉→定容→调pH值为9.5→加碱性蛋白酶→水浴酶解（2.5h、50℃）→取出沸水浴10min灭酶活→调pH值为8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（3h、40℃）→取出沸水浴10min灭酶活→调pH值为3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（2h、40℃）→取出沸水浴10min灭酶活→冷却→冷冻离心→取上清液→测定水解度[4]。

1.3.2 水解度测定[10]

核桃多肽液中氨基酸态氮采用甲醛滴定法测定，总氮按照国标GB/T5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定，水解度（DH）按下式计算：

1.3.3 核桃多肽总还原能力的测定[11]

核桃多肽总还原能力的测定采用普鲁士兰法。在2.5mL磷酸缓冲溶液（pH 6.6）中分别加入样品、维生素C、维生素E，添加量均为0、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL，双蒸水1.0mL、0.95mL、0.90mL、0.85mL、0.80mL、0.75mL、0.70mL，再加入质量分数1%铁氰化钾1mL，混合物在50℃恒温条件下，加热20min后，急速冷却，加2.5mL 10%三氯乙酸，3 500r/min离心分离10min。取上层清液2.5mL、双蒸水2.5mL，再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10min后在波长700nm条件下测吸光度值A700nm。A700nm越大，则样品的总还原力越大，抗氧化性就越好。

1.3.4 核桃多肽清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力测定[12]

采用邻苯三酚自氧化法。取pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液6mL，加入0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的样品各0.5mL，37℃水浴10min，最后加入37℃预热过的7mmol/L邻苯三酚盐酸溶液1mL，混匀后反应4min，用0.5mL浓盐酸终止反应，在波长325nm处测定其吸光度值A325nm，以等体积pH值为8.2的Tris-HCl 缓冲液作为空白吸光度值A0，超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为空白吸光度值；A为样品的吸光度值。

1.3.5 核桃多肽清除羟自由基（·OH）能力测定[13]

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法。吸取15mmol/L的邻二氮菲应用液1.5mL，先加入pH值为7.4的磷酸钠缓冲液4mL，充分混匀后再加入7.5mmol/L的FeSO4溶液1mL，立刻混匀。加入1mL质量浓度分别为0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的样品溶液后立即混匀，再加入1.5mL双蒸水，最后加入1%的H2O2溶液1.0mL，以双蒸水代替H2O2溶液，在波长536nm处测定其吸光度值A536nm，羟自由基清除率计算公式如下：

式中：A加药为加入样品（抗氧化剂）及H2O2溶液的吸光度值；A损伤为加H2O2而不加抗氧化剂溶液的吸光度值；A未损为两者都不加的溶液的吸光度值。

1.3.6 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）能力测定[14-15]

在10mL比色管中依次加入pH值为6.86磷酸盐缓冲液4mL，2×10-4mol/L的DPPH溶液（用体积分数95%乙醇配制）4mL，摇匀。再加入1mL待测液，用蒸馏水定容至10.00mL刻度，充分混匀，10min后用体积分数95%乙醇作参比，在波长520nm处测定其吸光度值，DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度值；Aj为不加DPPH，只加抗氧化剂及水的溶液的吸光度值；Ac为不加抗氧化剂，只加DPPH及水的溶液的吸光度值。

1.3.7 统计分析

数据均采用（平均值±标准差）表示；统计分析软件DPS 7.55对结果进行单因素方差分析和检验。

2 结果与分析

2.1 水解度的测定

最优条件制得的核桃多肽液水解度为45.58%，最优条件下酶解时间减半制得的核桃多肽液水解度为30.92%。

2.2 核桃多肽总还原能力的测定

核桃多肽的总还原能力与VC的总还原能力进行比较，结果见图1。

图1 核桃多肽总还原力测定Fig.1 Determination of total reducing power of different samples

由图1可知，核桃多肽液水解度为45.58%的总还原能力稍优于水解度为30.92%，但2种水解度的酶解液还原效果均弱于VC，且随着多肽液质量浓度的升高，样品的总还原能力也逐渐升高，后又基本趋于稳定，达到了VC总抗还原能力的60%～80%。说明其具有一定的总还原能力，即核桃多肽有一定的抗氧化性。

2.3 核桃多肽清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力测定

图2 不同水解度下核桃多肽质量浓度对O2-·的清除率Fig.2 Effect of walnut polypeptide concentration on O2-·scavenging activity under different hydrolysis degree

不同水解度下核桃多肽对O2-·的清除率结果见图2。由图2可知，核桃多肽液的质量浓度与超氧阴离子自由基的清除率呈现一定的量效关系，随质量浓度增加，超氧阴离子自由基的清除率呈现逐渐上升的趋势，核桃多肽液水解度为30.92%对超氧阴离子自由基的清除率稍优于水解度为45.58%，但2种水解度的酶解液对超氧阴离子自由基的清除效果均弱于VC，表明核桃多肽具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力。

2.4 核桃多肽清除羟基自由基（·OH）能力测定

不同水解度下核桃多肽液对·OH的清除率结果见图3。由图3可知，核桃多肽液对羟基自由基有较明显的清除作用，且随着核桃多肽液质量浓度的升高，其清除率也逐渐增强，核桃多肽液水解度为45.58%对羟基自由基的清除率优于水解度为30.92%，但2种水解度的核桃多肽液对羟基自由基的清除能力都低于VC，说明其具有一定的抗氧化能力。

图3 不同水解度下核桃多肽质量浓度对·OH的清除率Fig.3 Effect of walnut polypeptide concentration on·OH scavenging activity under different hydrolysis degree

2.5 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH）能力测定

不同水解度下核桃多肽液对DPPH的清除率见图4。由图4可知，水解度为45.58%及30.92%核桃多肽液对DPPH自由基都有清除作用，并且二者清除效果差别不大。在较低质量浓度时远低于VC的清除率，但随着其质量浓度的升高，DPPH自由基清除率逐渐上升，直到当核桃多肽质量浓度达到0.6mg/mL时清除率逐渐趋于稳定，说明核桃多肽具有一定的抗氧化性。

图4 不同水解度下核桃多肽液质量浓度对DPPH的清除率Fig.4 Effect of walnut polypeptide concentration on DPPH scavenging activity under different hydrolysis degree

3 结论

采用新疆产温-185核桃，利用榨完油后的残渣提取不同水解度核桃蛋白，并制备不同水解度的多肽液。以VC为对照，探讨了核桃多肽的总还原能力、对不同自由基的清除能力以及不同质量浓度对自由基清除率的影响。结果表明，核桃多肽对超氧阴离子自由基、羟基自由基以及DPPH自由基有一定的清除作用，且呈现出一定的量效关系，说明核桃多肽具有一定的抗氧化能力，有作为天然抗氧化剂进一步开发利用的价值。

[1]GHARIBZAHEDI S M T,MOUSAVI S M,HAMEDI M,et al.Determination and characterization of kernel biochemical composition and functional compounds of Persian walnut oil[J].J Food Sci Technol,2014,51(1):34-42.

[2]郗荣庭，张毅萍，奚声珂，等.中国果树志核桃卷[M].北京：中国林业出版社，2006.

[3]王加学，尼合迈提·霍嘉，桂 河.新疆南疆特色林果业发展策略分析[J].新疆农垦经济，2011，10（5）：49-52.

[4]尚新业.新疆核桃发展现状问题及对策[C].阿克苏：2012 年新疆核桃产业发展高峰论坛，2012.

[5]田宝远，安惠民，周 艳.核桃早熟优质、丰产、抗逆新品种温185 的选育[J].塔里木大学学报，2008，20（3）：77-80.

[6]田世儒，王太荣.优质薄壳核桃温185 丰产栽培技术[J].河北果树，2010（4）：49.

[7]张 宏，马 岩，张兆国，等.温-185 核桃壳断口形貌的研究[J].中南林业科技大学学报，2013，33（9）：103-106.

[8]杨宝求，张杰明，侯旭杰.压榨法和浸提法制备阿克苏温185 核桃油的研究[J].塔里木大学学报，2013，25（3）：28-33.

[9]贾靖霖，刘晓丽，侯旭杰，等.多酶协同水解核桃蛋白的研究[J].食品科技，2014（4）：340-342.

[10]薛文通，刘晓毅，李寿佳.微胶囊核桃粉加工工艺的研究[J].农业工程学报，2004，20（1）：230-233.

[11]端木凡林，樊云霞，阴景喜，等.核桃油及核桃脱脂蛋白粉制取工艺[J].中国油脂，1999，24（6）：20-21.

[12]易建华，朱振宝，董文宾.核桃蛋白酶解产物抗氧化性的研究[J].食品工业科技，2007，28（4）：85-86.

[13]齐西婷，杨 林，罗勤贵.核桃蛋白酶解物体外抗氧化研究[J].农产品加工刊，2009，163（2）：7-10.

[14]刘绍明，黄翠姬，孟陆丽，等.核桃蛋白中性蛋白酶水解物的制备及其抗氧化性活性研究[J].安徽农业科学，2008，36（35）：15696-15697，15701.

[15]刘绍明，黄翠姬，孟陆丽，等.核桃蛋白肽的抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2009，35（1）：58-61.