大鼠脊髓半横断损伤对脊髓神经元EGFL7表达的影响

万 一黄纯海* 张 方田 志张晶晶

（1 吉首大学第一附属医院神经外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大学第一附属医院康复科，湖南 吉首 416000）

大鼠脊髓半横断损伤对脊髓神经元EGFL7表达的影响

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（1 吉首大学第一附属医院神经外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大学第一附属医院康复科，湖南 吉首 416000）

目的探讨和分析大鼠脊髓半横断损伤对脊髓神经元EGFL7表达的影响。方法65只成年SD大鼠，随机分为正常对照组、假手术组、脊髓损伤组；建立脊髓半横断损伤模型（胸9～胸10），免疫组化法检测大鼠脊髓EGFL7表达。结果未发生脊髓损伤，EGFL7表达于腹角Ⅸ板层的运动神经元和背角Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ板层的小神经元；脊髓半横断损伤后，灰质神经元EGFL7表达水平随着时间逐渐增加，7 d达到高峰，随后降低，21 d后维持稳定；脊髓损伤组脊髓神经元EGFL7免疫组化IRS评分与对照组比较具有差异统计学意义（P＜0.05）。结论EGFL7的表达变化与脊髓运动功能改变具有相关性，其可能参与脊髓损伤再生修复过程。

类表皮生长因子域7；脊髓损伤；大鼠

经研究表明，缺氧预处理大鼠脑组织EGFL7表达显著上调并伴随微血管密度增加[1,2]；氧暴露新生大鼠的肺组织内皮细胞中明显下降，减少氧暴露可回复正常表达水平；在体外培养的人内皮细胞中，高氧暴露明显下调EGFL7表达，EGFL7表达与缺氧及其诱导的血管新生过程相关。因此，本研究通过建立实验性大鼠脊髓半横断损伤模型，免疫组化法分析急性期和恢复期神经元组织EGFL7表达变化和下肢功能恢复状况，进而探讨EGFL7在脊髓损伤急性期的神经元功能维持和神经元损伤修复过程的作用，为进一步探讨脊髓损伤再生修复的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型构建

成年的健康清洁级雄性SD大鼠65只，体质量为（205.6±26.3）g，按随机分为3组，分别是正常对照组（5只）、假手术组（30只，分别于2、3、7、14、21、30 d进行脊髓样本取材，每个时间点取5只）、脊髓损伤模型组（30只，分组大鼠数量同假手术组）。戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，于胸9～10节段水平制作脊髓半横断损伤模型，假手术组不损伤脊髓，仅剪开硬脊膜后缝合。

1.2 灌注、固定及取材

脊髓半切损伤建模手术后，于术后2、3、7、14、21、30 d分别进行脊髓组织取材。按常规动物取材方法，戊巴比妥钠麻醉大鼠，开胸、于胸9～10节段选取脊髓组织，福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片，取首尾各一张切片，常规苏木精-伊红染色行显微镜下观察确定该系列连续切片为相应脊髓神经元组织，切片用于后期的免疫组化分析。

1.3 免疫组化染色及结果判定

常规HE染色连续切片证实的脊髓神经元的组织切片行免疫组化染色（ABC法）。大鼠EGFL7-抗为上海生工产品（浓度为1∶500）4 ℃置2 d；二抗（1∶200）37 ℃置1.5 h，DAB显色5 min，苏木素复染，自来水冲洗蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。结果判定及计数，镜下观察，胞质呈棕黄色为EGFL7免疫阳性细胞。以中央管为中心，与脊髓前后正中沟相垂直作一直线，每只大鼠随机取5张切片，在光镜下计数其中一边腹侧灰质中有明显细胞核的阳性细胞数，阳性产物表现为境清楚突出背景棕黄色或棕褐色颗粒。脊髓免疫组化计分采用IRS法，并略作修改：在高倍镜（×200）计数前角细胞阳性细胞数，根据染色强度、阳性细胞数和二者计分的乘积进行综合判断，图像分析采用试用版Image-Pro Plus 6.0软件。

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0 进行分析，采用百分比、均数、标准差进行描述性统计，组间比较应用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

对照组、假手术组（2、3、7、14、21、30 d）、脊髓半横断损伤组（2、3、7、14、21、30 d）灰质神经元EGFL7的免疫组化IRS评分比较（表1）。

表1 灰质神经元EGFL7的免疫组化IRS评分比较（n=65）

3 讨 论

EGFL7是一种新发现的由特异性内皮细胞分泌的血管活性因子，其基本生理功能是胚胎发育和血管损伤时促进血管生成。然而，随着研究深入发现EGFL7也在多种细胞类型中存在表达，包括胚胎干细胞、精原细胞、大脑皮质神经元及某些上皮源性恶性肿瘤细胞等。大量的研究结果和本研究组前期研究结果均提示，EGFL7表达与缺氧及其诱导的血管新生过程密切相关。脊髓半横断损伤过程伴随最显著的病理生理过程即存在缺血缺氧损伤过程，缺氧所诱导的新生血管广泛存在于脊髓半横断损伤修复过程。因此，我们通过建立实验性脊髓半横断损伤模型并采用同期BBB功能评定法和EGFL7染色免疫组化法定量分析脊髓半横断损伤修复过程中EGFL7表达与脊髓损伤修复的相关性。

本研究结果提示，EGFL7可能在维持正常脊髓神经元功能及损伤后的修复的一种潜在的脊髓神经可塑性调节因子，但在正常脊髓神经元中是否具有参与调节神经可塑性和维持足够数量神经元存活的作用还需进一步证实。本研究发现，在脊髓半横断损伤后，EGFL7表达从3 d后显著上调，一直持续到伤后21 d（表1），其表达水平与大鼠的后肢运动功能恢复呈显著负相关（R2=0.619，r=-0.787，P=0.016）。该结果提示，EGFL7可能参与脊髓神经损伤修复和可塑性调节过程。EGFL7的功能具有组织和细胞特异性，其功能可能涉及神经细胞分化、细胞黏附、缺氧存活、血管生成，以及免疫调节等病理和生理过程。本研究结果提示，脊髓损伤后的运动功能修复过程与脊髓神经元表达EGFL7水平呈现明显的负相关，其机制可能在于血管损伤或缺氧刺激神经元表达EGFL7，进而调节血管内皮细胞的群集性迁移而参与血管新生。

综上所述，本文结果初步提示，EGFL7可能参与维持正常脊髓神经元功能，并可能在脊髓损伤后运动功能恢复过程中发挥作用。

[1] Fitch MJ,Campagnolo L,Kuhnert F,et al.Egfl7,a novel epidermal growth factor-domain gene expressed in endothelial cells[J].Dev Dyn,2004,230(2):316-324.

[2] Gustavsson M,Mallard C,Vannucci SJ,et al.Vascular response to hypoxic preconditioning in the immature brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):928-938.

R651.2

B

1671-8194（2014）17-0079-02

湖南省科技厅科技计划项目（应用基础研究科技专项：2011FJ6050）；湘西州科技计划项目

*通讯作者：E-mail:huangchunhai2001@126.com