肺炎克雷伯菌突变株的分离和全转录组分析

刘 岩，常 德，黄佩佳，姜学革，苏龙翔，岑 忠，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2武警总医院 呼吸科，北京 100039；3深圳华大基因研究院，广东深圳 518083

基础研究

肺炎克雷伯菌突变株的分离和全转录组分析

刘 岩1，常 德2，黄佩佳1，姜学革1，苏龙翔1，岑 忠3，刘长庭1

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2武警总医院 呼吸科，北京 100039；3深圳华大基因研究院，广东深圳 518083

目的筛选空间环境诱变的肺炎克雷伯菌突变株及并进行全转录组分析。方法利用Biolog生化反应板从搭载于神舟八号飞船的肺炎克雷伯菌中筛选突变株，然后采用高通量测序技术对突变株全转录组测序，原始测序数据经处理后进行基因表达注释和差异表达基因的基因本体功能及京都基因与基因组信号通路注释分析。结果空间搭载的肺炎克雷伯菌突变株在糖类代谢上出现差异，且该菌株有232个基因表达上调，1 879个基因下调，其主要同细菌的膜蛋白、转运相关功能、糖类的运输相关。结论获得一株空间环境诱导的肺炎克雷伯菌突变株且该菌株全转录组测序和注释清晰，为后续的功能研究奠定了基础。

克雷伯菌，肺炎；转录组；测序；空间环境

克雷伯菌是革兰阴性杆菌，属于肠杆菌，属兼性厌氧菌，常存在于人体上呼吸道和肠道中[1]。肺炎克雷伯菌是一种无处不在的条件致病菌，寄生在人类的呼吸道，对人致病性较强，并导致严重的疾病，如败血症、肺炎、尿路感染、软组织感染[2-3]。随着航天技术的发展，人类的外太空探索活动越来越频繁。在载人航天活动中，肺炎克雷伯菌可随航天员进入太空，暴露于空间环境下的该菌株是宇航员健康的潜在威胁。因此，研究空间环境下肺炎克雷伯菌的变异及其规律对载人航天具有重要的意义。

材料和方法

1 材料 肺炎克雷伯菌(LCT-KPD)为地面对照组，来自中国菌种保藏中心。肺炎克雷伯菌(LCTKPT)为空间搭载组，从搭载于中国神舟八号飞船的肺炎克雷伯菌中分离获得。高通量测序仪HiSeq 2000为Illumina公司生产，Biolog生化反应板GENⅢMicroPlateTM来自美国Biolog公司，总RNA提取试剂盒购自天根公司。

2 突变株的分离 将返回地面的搭载神舟八号飞船肺炎克雷伯菌接种于MH平板中，挑选100株单克隆子代菌株并培养至对数生长期，取2 ml菌液6 000 r/s离心5 min，弃上清，用0.9%氯化钠注射液洗涤菌体，用Biolog接种液悬浮菌体后，调整浓度为107～ 108/ml；菌悬液加入Biolog板孔中，放置在37℃下培养，24 h和48 h进行观察，并记录结果。

3 RNA的提取和转录组测序 利用天根细菌总RNA提取试剂盒提取肺炎克雷伯菌对照组和实验组总RNA，利用Agilent 2100、Qubit Fluorometer、琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度、片度大小、RIN、沉降系数(S)28和18。去除rDNA后，将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加PolyA并连接测序接头，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增。建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。

4 转录组测序数据的过滤和评估 经测序获得的原始序列带有Adaptor序列或低质量序列，通过软件去除含Adaptor序列的最小误取单位，实际未测出碱基(N)比例＞5%的Reads、低质量Reads，得到纯净(clean)Reads。利用SOAPaligner/soap2软件将Clean reads比对到参考基因组和参考基因序列，统计Clean reads比对到参考基因组、参考基因上的比例，获得对数据的总体评估。用Clean reads比对参考rRNA序列，评估rRNA序列以利于后续分析中去除这些数据；为进一步分析测序的可靠性，通过把Reads在基因上的位置标准化到相对位置，统计基因的不同位置比对上的Reads数，以评估测序过程中的打断随机性。

5 基因表达 注释每个基因被Reads覆盖的百分比，通过分析基因的覆盖度进一步评估测序数据；利用每个碱基长度Reads数(reads per kilobase of exon model per million mapped reads，RPKM)法计算基因表达量以进行差异基因的表达分析。获得差异表达基因后，对其进行基因本体(gene ontology，GO)功能和京都基因与基因组(Kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG)信号通路的注释分析，从而明确空间环境诱导的突变株表达改变基因的分类，为研究空间环境对肺炎克雷伯菌的作用提供线索。

结果

1 突变菌株的筛选和分离 对随机挑选的100株子代细菌进行Biolog表型谱研究后，发现其中一株菌株在利用D-海藻糖、N-乙酰神经氨酸、D-甘露醇、肌醇、黏液酸、D型砂糖酸和α-酮戊二酸等底物方面存在差异(表1)，因此将该株肺炎克雷伯菌作为研究对象进行下一步的转录组序列测定和分析。

图 1 LCT-KPT及LCT-KPD的基因覆盖度Fig.1 Distribution of genes' coverage of LCT-KPT and LCT-KPD

表1 地面对照和空间搭载组间Biolog代谢谱差异Tab. 1 Phenotypic characteristics of LCT-KPTand LCT-KPD

表2 转录组测序结果同参考基因组比对的统计结果Tab. 2 Alignment statistics of sequencing results mapped to Genome (n, %)

2 转录组基因覆盖度分析 将转录组测序Reads对比至原始菌株基因组和基因上，95%以上Reads都能比对至参基因组上(表2)，比对至参考基因上的Reads比例也达到36.03%，表明转录组测序数据结果基本能反映研究菌株的整个转录组。从基因覆盖度的角度也证实基因组上大部分基因已覆盖(图1)。这些测序数据的质量、数量分析和评估为后续的基因表达差异分析奠定了基础。

3 基因差异表达分析和注释 通过测序获得两组样本基因的表达量，按FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1标准进行统计，同地面对照相比，太空搭载组有232个基因表达上调，1 879个基因下调。GO功能注释分析集中细胞膜结构相关蛋白；KEGG信号通路注释改变磷酸酶转移系统(phosphotransferase system，PTS)、ABC转运器、果糖和甘露糖代谢、丁酸代谢、磷酸肌醇代谢、半乳糖代谢、二甲苯降解、丙酸代谢、苯丙氨酸代谢、细菌分泌系统、苯甲酸降解和维生素C代谢(P＜0.01)(表3)。由此可见，空间环境突变株在细菌的膜蛋白、转运相关功能、糖类的运输、磷酸化等方面变化明显，表明糖类转运系统对于细菌的生存十分重要，同时细菌对环境的适应性变化受糖类运输系统的调节。

讨论

随着我国“神舟”系列飞船、“天宫一号”、空间站等庞大航天计划的实施，为空间生物医学研究提供了难得的实验平台。借助太空失重、高真空、微磁场和粒子辐射等特殊的环境，利用空间飞行器的特殊实验条件，科学家们可以开展许多地面上无法实现的科学实践和研究活动，最终再惠及地面[4]。美国航空航天局2008年开展的肺炎链球菌空间研究项目发现细菌在太空空间环境中的毒力和致病性会发生改变，对外界环境抵抗力增强以及对抗生素的敏感性下降[5-6]。因此，通过空间搭载研究空间环境对细菌的作用和影响机制有利于评估空间生物安全，另一方面，为地面研究细菌变异提供新手段。

肺炎克雷伯菌又称肺炎杆菌，是一种广泛分布于自然界的最常见革兰阴性菌，为人体的正常菌群。在接受侵入性诊疗或者免疫功能低下的患者中常可导致呼吸道感染、尿路感染、腹腔感染、败血症、化脓性脑膜炎、皮肤软组织感染和伤口感染等，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要机会性致病菌和医源性感染菌[3]。近年来随着临床上广谱抗菌药物的大量应用，其检出率和耐药率呈上升趋势[7]。地面的研究手段非常有限；另一方面，该种机会性致病菌可随航天员进入太空，严重威胁载人航天的安全[8]。因此，为更好了解肺炎克雷伯菌株的各项生物学特性和空间变异规律，为保障航天员健康和临床诊治提供基础，我们利用全新的测序技术对该菌株进行基因组测序。

本研究借助神舟飞船搭载平台，将肺炎克雷伯菌搭载于神舟八号飞船，返回地面后通过表型筛选获得突变株[7,9-10]。进而对突变株进行转录组测序分析，得到一批表达差异的基因，这些基因主要分布于膜蛋白，参与糖类代谢、磷酸化和转运等相关功能，为研究肺炎克雷伯菌的地面和空间变异提供了大量的候选分子。然而，本研究中搭载的肺炎克雷伯菌主要受失重的影响，后续的搭载研究可考虑让其暴露于更加真实的空间环境。

表3 差异表达基因的KEGG信号通路注释分析Tab. 3 KEGG pathway annotation of DEGs (n, %)

1 Chong Y， Shimoda S， Yakushiji H， et al. Community spread of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis： a long-term study in Japan［J］. J Med Microbiol， 2013， 62（Pt 7）： 1038-1043.

2 Tsai SS， Huang JC， Chen ST， et al. Characteristics of klebsiella pneumoniae bacteremia in community-acquired and nosocomial infections in diabetic patients［J］. Chang Gung Med J， 2010， 33（5）：532-539.

3 Lee CY， Chen PY， Huang FL， et al. Microbiologic spectrum and susceptibility pattern of clinical isolates from the pediatric intensive care unit in a single medical center - 6 years’ experience［J］. J Microbiol Immunol Infect， 2009， 42（2）：160-165.

4 Su L， Chang D， Liu C. The development of space microbiology in the future： the value and significance of space microbiology research［J］. Future Microbiol， 2013， 8（1）： 5-8.

5 Jules K. Summary of the science performed onboard the International Space Station during increments 12 and 13［J］. Acta Astronaut，2008， 63 （1/4）： 38-52.

6 Matin A， Lynch SV， Benoit MR. Increased bacterial resistance and virulence in simulated microgravity and its molecular basis［J］. Gravitation and Space Biology， 2006， 19（2）： 31-42.

7 Su LX， Zhou LS， Liu JW， et al. Phenotypic， genomic， transcriptomic and proteomic changes in Bacillus cereus after a short-term space flight［J］. Adv Space Res， 2014， 53（1）： 18-29.

8 刘长庭.空间环境对微生物的影响及意义［J］.军医进修学院学报，2012，33（5）：433-434.

9 Wang YJ， Yuan YT， Liu JW， et al. Transcriptomic and proteomic responses of Serratia marcescens to spaceflight conditions involve large-scale changes in metabolic pathways［J］. Adv Space Res，2014， 53（7）：1108-1111.

10 Chang D， Zhu Y， An L， et al. A multi-omic analysis of an Enterococcus faecium mutant reveals specific genetic mutations and dramatic changes in mRNA and protein expression［J］. BMC Microbiol， 2013， 13： 304.

Isolation and transcriptome sequencing of Klebsiella pneumonia mutant strain

LIU Yan1, CHANG De2, HUANG Pei-jia1, JIANG Xue-ge1, SU Long-xiang1, CEN Zhong3, LIU Chang-ting1
1Department of Respiratory Diseases in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Respiratory Medicine, General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces, Beijing 100039, China;3BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, Guangdong Province, China

LIU Chang-ting. Email: liuchangt@gmail.com

ObjectiveTo screen the space environment induced Klebsiella pneumonia mutant strain and study its transcriptome.MethodsThe Klebsiella pneumonia mutant strain was screened from which loaded on Shenzhou-Ⅷ space craft using Biolog GEN Ⅲ Micro Plate TM. Then whole transcriptome was sequenced with high-throughput sequencing technology, and gene expression annotation, GO annotation and KEGG signaling pathway annotation were analyzed for differentially expressed genes with processed raw sequencing data.ResultsKlebsiella pneumoniae mutant showed differences with controls in carbohydrate metabolism. This mutant strain had 232 genes up regulated and 1879 genes down regulated, which were mainly associated with bacterial membrane proteins, transportrelated functions and carbohydrate transport.ConclusionOne space environment-induced Klebsiella pneumoniae mutan strain is obtained, and the whole transcriptome sequencing and annotation are clear, which lays foundation for subsequent functional studies.

Klebsiella pneumonia; transcriptome; sequencing; space environment

R 85

A

2095-5227(2014)12-1234-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.12.016

时间：2014-08-29 09:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140829.0957.001.html

2014-06-16

国家“973”重点基础研究计划(2014CB744400)；武器预研重点基金(9140A26040312JB10078)；载人航天领域项目(040203)；国家自然科学基金(81350020)

Supported by National “973” Program for Basic Research of China(2014 CB744400); the National Natural Science Foundation of China(81350020)

刘岩，女，主管技师。Email: lymtk@126.com

刘长庭，男，教授，主任医师，博士生导师。Email: liuchangt@gmail.com