兔动脉粥样硬化模型血清TNF-α与斑块内细胞凋亡的相关性研究

郭寻竹，宋丽萍

辽宁医学院附属第一医院 核医学科，辽宁锦州 121001

兔动脉粥样硬化模型血清TNF-α与斑块内细胞凋亡的相关性研究

郭寻竹，宋丽萍

辽宁医学院附属第一医院 核医学科，辽宁锦州 121001

目的探讨TNF-α在动脉粥样硬化斑块形成中的作用。方法10只雄性大耳白兔随机分为模型组(A组)和正常对照组(B组)，每组5只。模型组通过球囊损伤腹主动脉内膜，并饲喂高脂饲料15周；对照组普通饲料喂养15周。于实验前及15周末，经耳缘静脉空腹取血，进行血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholested，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholested，LDL-C)、TNF-α的测定，并处死动物分离腹主动脉，进行光学显微镜观察，TUNEL免疫组化检测细胞凋亡。结果兔动脉粥样硬化模型制备成功。模型组与对照组比较，TG、TC、LDL-C、TNF-α均显著增高(P均＜0.05)。TG、TC、LDL-C与TNF-α均呈显著正相关(P均＜0.05)，与HDL无明显相关性。模型组血清TNF-α水平与腹主动脉斑块内细胞凋亡指数呈显著正相关。结论TNF-α可能参与了动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡，血清TG、TC、LDL-C、TNF-α是动脉粥样硬化的危险因素。

动脉粥样硬化；血脂；肿瘤坏死因子

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种全身、弥漫性的血管壁慢性炎症性疾病，可导致许多重要器官尤其是心、脑、肾等的改变，其病理过程与炎症因子密切相关[1-2]，是危害人类健康的常见疾病之一。多种炎症因子如TNF-α、INF-γ、IL-6等参与了其病变过程，细胞凋亡也参与了AS的发生发展过程[3]。本研究通过兔动脉粥样硬化斑块模型血清TNF-α及腹主动脉血管片段细胞凋亡的检测，探讨二者在动脉粥样硬化斑块形成中的作用。

材料和方法

1 实验动物 健康雄性大耳白兔10只，体质量2.5 ～3.5 kg，均由辽宁医学院动物实验中心提供。家兔分笼饲养于温度18 ～ 24℃，光照明暗各12 h清洁的饲养室内。

2 材料与试剂 普通饲料：辽宁医学院动物实验中心提供。胆固醇购自安徽天启化工科技有限公司。蛋黄粉及猪油均为市售。高脂饲料配制：胆固醇2%、蛋黄粉10%，熟猪油5%均匀混合于普通饲料，由辽宁医学院动物实验中心配制。兔血清TNF-α酶联免疫试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司。

3 动脉粥样硬化斑块模型的制备 10只雄性大耳白兔，随机分为模型组和正常对照组，每组各5只。模型组给予高脂饮食(内含2%的胆固醇和5%猪油)饲养2周后，10%水合氯醛(3 ml/kg)静脉注射麻醉动物，腹股沟区触摸股动脉搏动，纵向切开皮肤，分离皮下组织，钝性分离股动脉、静脉和神经。切开股动脉，球囊导管插入股动脉，上行插入约30 cm后，给球囊注入0.9%氯化钠注射液0.2 ml，向下拖拉球囊至髂总动脉分叉处，反复3次。缝合动脉切口和皮肤，青霉素80万U腹腔注射3 d，防止感染。术后继续给予含2%胆固醇和5%猪油的高脂饲料15周。正常对照组给予普通饲料喂养15周。

4 血标本采集与检测 于实验前及15周末处死动物前禁食≥12 h，经耳缘静脉空腹取血收集于生化试管中，静置后离心分离血清，取上清液放置于-80℃待检。应用全自动生化分析仪检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholested，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholested，LDL-C)。酶联免疫法测定TNF-α的浓度。

5 病理 于15周末，模型组和对照组兔，注射过量的10%水合氯醛处死动物，进行解剖。小心暴露动物心脏与髂总动脉分叉之间的胸腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织，取出腹主动脉。将离体血管标本经石蜡包埋、切片，行HE染色，在光学显微镜下观察。取石蜡切片行原位末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)检测，正常细胞核呈蓝紫色，凋亡细胞核呈棕色。随机取5个TUNEL阳性细胞的高倍视野，每个视野计数细胞总数及阳性细胞数，取平均值，计算凋亡细胞指数(AI，%) = (凋亡细胞数÷细胞总数)×100%。

6 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，所有数据用±s表示，两组间数据比较采用独立样本t检验；相关性分析用Pearson相关分析法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AS模型制备情况 经球囊损伤血管内皮及高脂饮食后，15周后模型组腹主动脉AS模型制备成功。光学显微镜下可见纤维帽形成，脂质坏死中心，细胞外基质及平滑肌细胞很少(图1)。对照组主动脉光镜下显示：正常主动脉壁、内膜、中膜、外膜均清晰可见，各层结构正常(图2)。模型组AS斑块中的细胞凋亡比对照组多，凋亡指数分别为(33.51±9.87)%和(15.41±6.14)%，差异有统计学意义，见图3、图4。

2 两组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C比较 15周时，对照组TC、TG、HDL-C和LDL-C水平同实验前基础值比较差异无统计学意义(P＞0.05)，而模型组与实验前及对照组比较TC、TG、LDL-C显著增高(P＜0.05)。见表1。

3 两组血清TNF-α水平比较 15周后对照组血清TNF-α水平同实验前比较差异无统计学意义(P＞0.05)，而模型组血清TNF-α水平与实验前及对照组比较显著增高(P＜0.05)。见表2。

4 TNF-α与血脂的相关分析 血清TNF-α水平与血清TC，TG及LDL-C水平均呈显著正相关(P＜0.05)。与HDL-C无明显相关性(P＞0.05)，见表3。

图 1 球囊损伤组兔动脉粥样硬化HE 染色切片图(×200)可见大的脂质坏死中心，并有薄的纤维帽图 2 正常兔腹主动脉内皮HE 染色切片图(×200)图 3 模型组血管片段TUNEL 检测结果，凋亡细胞核为棕色图 4 对照组血管片段TUNEL 检测结果，正常细胞核为蓝紫色，凋亡细胞核为棕色Fig. 1 A large lipid necrosis center with thin fbrous cap in HE-stained section of rabbit abdominal aorta artherosclerotic tissue(×200)Fig. 2 Normal HE-stained section of rabbit abdominal aorta endothelial tissue (×200)Fig. 3 TUNEL showing blood vessel segments with brown apoptotic nuclei in model groupFig. 4 TUNEL showing blood vessel segments with bluish violet normal nuclei and brown apoptotic nuclei in control group

表1 各组实验兔血脂水平的变化Tab. 1 Serum lipid level in experimental rabbits (mmol/L, n=5)

表2 各组实验兔血清TNF-α的变化Tab. 2 Serum TNF-α level in experimental rabbits(ng/L)

表3 模型组15周血清TNF-α与TC, TG, LDL-C, HDL-C的相关分析Tab. 3 Correlation between serum TNF-α level and serum levels of TC, TG, LDL-C, HDL-C in model group at 15th week(n=5)

5 模型组TNF-α与腹主动脉血管内皮凋亡指数的相关性 模型组15周血清TNF-α水平与腹主动脉斑块内凋亡指数呈显著正相关，相关系数为0.912(P＜0.05)。

讨 论

动脉粥样硬化是一个缓慢而复杂的病理过程[4]，是冠心病和缺血性脑卒中的主要病因[5]。而炎症是导致动脉粥样硬化病变起始和发展的主要因素。一些文献报道，AS斑块内的单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等可分泌多种炎性因子如IL-1β、IL-6、INF-α和IFN-γ等，这些炎症因子产生更多细胞因子，进一步加重了粥样斑块的发展[6]。TNF-α和IL-6是强烈的促炎性细胞因子，在动脉粥样硬化斑块形成和破裂中起到重要作用[7]。

TNF-α是由激活的巨噬细胞或非巨噬细胞如单核细胞、淋巴细胞等产生的一种多肽。TNF-α主要参与血管内皮细胞的损伤、促进炎性细胞的聚集和炎性介质的释放[8]，参与动脉粥样硬化的发生和发展。一些动物实验表明，动脉粥样硬化时TNF-α的水平明显增高，林秋雄等[9]发现兔动脉粥样硬化模型血清TNF-α水平明显高于对照组，而常炳堃和吕晓东[10]发现动脉粥样硬化模型大鼠心脏组织中TNF-α的表达明显高于对照组。

本研究结果显示：兔动脉粥样硬化组血清TNF-α水平明显高于对照组。与文献报道一致。其主要原因为：AS病灶内的巨噬细胞可产生大量TNF-α。此外，AS病灶内的血管平滑肌细胞和激活的T淋巴细胞也可产生TNF-α。表明TNF-α可作为动脉粥样硬化预测的危险因子。

本研究结果还证实：血清TNF-α水平与血管内皮细胞凋亡指数呈显著正相关。分析其原因：动脉粥样硬化斑块中存在多种细胞的凋亡与坏死，如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等[11]。而在AS斑块中由单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞分泌的炎性介质TNF-α，又可以促进和诱导血管内皮细胞及血管平滑肌细胞出现凋亡。

传统观点认为：血脂异常是AS形成的主要危险因素[12]，脂质代谢紊乱与动脉粥样硬化的形成密切相关，研究显示：血脂持续异常是促进AS发生及发展的重要因素[13]。LDL-C已被证实是动脉粥样硬化疾病的主要危险因素[14]，LDL-C的促AS作用已被大量实验所证实，降低LDL-C也成为AS相关性疾病的防治措施之一[15]。HDL在生理活动中起到重要作用，可降低胆固醇的含量，从根本上有效预防和治疗动脉粥样硬化。本研究中模型组TG、TC、LDL-C水平明显高于对照组。同时病理学证实：模型组有动脉粥样斑块形成。这说明模型组球囊损伤加高脂饮食促进了兔血管内膜粥样斑块的形成。

本研究结果还证实：血清TNF-α水平与血清TC，TG及LDL-C水平均呈显著正相关，与HDL-C无相关性。表明TNF-α与血脂关系密切，有可能共同参与动脉粥样硬化的发病机制，但还有待进一步研究。

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10 常炳堃，吕晓东．动脉粥样硬化模型大鼠ADP与TNF-α表达水平相关性研究［J］.实用中医内科杂志，2011，25（5）：48-49．

11 Kavurma MM， Bennett MR. Expression， regulation and function of trail in atherosclerosis［J］. Biochem Pharmacol， 2008， 75（7）：1441-1450.

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Correlation between serum TNF-α level and apoptosis in rabbit atherosclerotic plaque model

GUO Xun-zhu, SONG Li-ping
Department of Nuclear Medicine, First Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China Corresponding author: SONG Li-ping. Email: lipingsong188@163.com

ObjectiveTo study the role of serum TNF-α level in formation of atherosclerotic plaques. MethodsTen male big ear rabbits were randomly divided into model group (group A, n=5) and normal control group (group B, n=5). After damage to abdominal aorta intima was induced with balloon, the animals in group A were fed with high fat diet for 15 weeks while those in group B were fed with normal diet for 15 weeks. Fasting blood was taken from the ear marginal vein to measure the serum levels of TC, TG, HDL-C, LDL-C and TNF-α before and by the end of week 15. The animals were killed. Their abdominal aorta was isolated and observed under optical microscope. Apoptosis was detected by TUNEL. ResultsThe animal atherosclerosis model was successfully established. The serum levels of TC, TG, LDL-C and TNF-α were significantly higher in group B than in group A (P＜0.05). The serum levels of TC, TG and LDL-C were positively related with the serum TNF-α level (P＜0.05). However, the serum HDL-C level was not signifcantly related with the serum TNF-α. level. The serum TNF-α level was positively related with the apoptosis index in abdominal aorta plaques. ConclusionTNF-α may be involved in apoptosis in atherosclerotic plaques. Serum levels of TG, TC, LDL-C and TNF-α are the risk factor for atherosclerosis.

atherosclerosis; blood lipid; TNF-α

R 543.3

A

2095-5227(2014)02-0174-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.022

2013-11-04 10:46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131104.1046.001.html

2013-09-16

辽宁省科技厅资助项目(201102129)

Supported by the Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(201102129)

郭寻竹，女，学士，主治医师。研究方向：核心脏病学。Email: guoxunzhu0416@163.com

宋丽萍，女，博士，教授。Email: lipingsong188@163.com