中药白疕合剂对银屑病样动物模型影响的实验研究

卢益萍 李忻红 马贤德 董灵玉

银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病［1］。现代研究证实，炎症细胞浸润、微血管改变及表皮角质形成细胞的过度增殖为银屑病病理改变的三个特征［2］。从表皮细胞增殖及微血管角度进行银屑病机制研究是目前研究热点，本研究通过建立银屑病样实验动物模型从血清中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量、cAMP/cGMP 比值及血管内皮生长因子(vascular endothelial growh factor，VEGF)水平方面，研究中药白疕合剂治疗银屑病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂

白疕合剂(院内自制中药浓缩煎剂，制剂号:Z05010105，主要组成:丹参15 g、地黄20 g、赤芍20 g、山豆根20 g、板蓝根20 g、金银花30 g、白茅根20 g、白花蛇舌草30 g、全蝎10 g、黄柏20 g);消银颗粒(陕西康惠制药股份有限公司，批号:Z20000019，组成:地黄、牡丹皮、当归、苦参、金银花、玄参、牛蒡子、蝉蜕、白鲜皮、防风、大青叶、红花);cAMP、cGMP 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(上海越研生物科技有限公司提供，批号201210);VEGF ELISA检测试剂盒(晶美生物工程有限公司提供)。5%盐酸普萘洛尔乳剂(纯盐酸普萘洛尔原料药由天津力生制药股份有限公司提供，批号H12020151，乳剂基质由沈阳市日用化工厂提供，取盐酸普萘洛尔原料药加入基质中配制)。

1.2 动物

健康豚鼠60 只，体重(300±30)g，雄雌各半，购自大连医科大学，动物许可证号:SCXK(辽)2008-0002，分笼饲养于实验动物中心实验室。

1.3 仪器

电子天平(上海精密科学仪器有限公司生产)、电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂生产)、低温高速离心机(德国HERAEUS 生产)、酶标仪(奥地利Anthos Labtec Instruments 生产)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 健康豚鼠，采用随机数字表法随机分为6 组:(1)正常组;(2)模型组、(3)白疕合剂低剂量组;(4)白疕合剂中剂量组;(5)白疕合剂高剂量组;(6)消银颗粒组。

1.4.2 动物造模 先脱去豚鼠背毛，约4 cm×4 cm大小，3 天后开始实验。对照组脱毛处仅外涂乳剂基质，其余各组均外涂5%盐酸普萘洛尔乳剂，范围约3 cm×3 cm(1 cm×1 cm 用药0.3 g)，2 次/天，连续3周。造模成功，造成豚鼠背部的银屑病样动物模型。

1.4.3 用药 灌胃量4 ml/只，白疕合剂用药量(成人每日100 ml/70 kg)，按照人与豚鼠体表面积比例进行换算，计算得出豚鼠给药剂量为每天7.74 ml/kg，以此浓度设定为中剂量组，低剂量组给药剂量为3.87 ml/kg，高剂量组给药剂量为15.48 ml/kg。阳性对照组按人鼠等效剂量灌胃，消银颗粒组为0.81 g/kg。正常组与模型组豚鼠每日以等量生理盐水灌胃。

1.4.4 ELISA 法检测对血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影响 上述豚鼠未处死前取血，离心2000 r/min，取血清，采用酶联免疫试剂盒，按试剂盒说明书要求进行检测光密度，根据标准曲线计算结果，根据结果计算cAMP/cGMP 比值。

1.4.5 ELISA 法检测对血清血管内皮生长因子水平的影响 上述豚鼠未处死前取血，离心2000 r/min，取血清，采用酶联免疫试剂盒，按试剂盒说明书要求进行检测光密度，根据标准曲线计算结果。

1.5 统计学方法

所获数据采用SPSS 11.0 版本软件进行分析。计量资料实验数据以(±s)表示，并进行单因素方差分析。方差齐性检验采用Levene 法。各样本间比较应用SNK 检验，实验组与对照组比较用Dunnett-t 检验，各组两两比较用LSD 检验。

2 结果

2.1 对血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影响

银屑病豚鼠模型血清cAMP 含量均显著降低，cGMP 含量均显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，白疕合剂各剂量组和消银颗粒组cAMP 含量均显著升高(P＜0.01)，cGMP 含量均降低(P＜0.01)，cAMP/cGMP 比值均升高(P＜0.01);消银颗粒组与白疕合剂高剂量组cGMP 含量及cAMP 含量比较均有统计学意义(P＜0.05)。消银颗粒组与白疕合剂各剂量组cAMP/cGMP 比值比较无统计学意义(P＞0.05)。提示白疕合剂能够增高银屑病豚鼠模型血清中cAMP 的含量，降低银屑病模型豚鼠血清中cGMP 的含量，白疕合剂高剂量效果优于消银颗粒。白疕合剂能够升高银屑病模型豚鼠血清中cAMP/cGMP比值，且随浓度的增高作用增强，对cAMP/cGMP比值的调节，白疕合剂与消银颗粒无差别，见表1、图1。

表1 对血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影响(±s，n=8)

表1 对血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影响(±s，n=8)

注:与空白对照组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＜0.01;与消银颗粒组比较，cP＜0.05;与消银颗粒组比较，dP＞0.05

组别 cAMP(pmol/ml)cGMP(pmol/ml)cAMP/cGMP空白对照组 25.79±1.96b 1.91±0.09b 13.54±1.49 b模型组 5.18±0.35a 4.15±0.12a 1.25±0.09a白疕高剂量组 10.00±0.46abc 3.14±0.10abc 3.18±0.12abd白疕中剂量组 9.57±0.63ab 3.26±0.15ab 2.94±0.25abd白疕低剂量组 8.83±0.34ab 3.66±0.13ab 2.42±0.08abd消银颗粒组 9.11±0.26ab 3.27±0.14ab 2.79±0.16 ab

图1 各组血清cAMP/cGMP 比值的比较

2.2 对血清VEGF 水平的影响

银屑病豚鼠模型血清VEGF 显著高于正常组，造模成功。经治疗，中药白疕合剂治疗各剂量组与消银颗粒组血清VEGF 均低于模型组(P＜0.01)，高剂量组与空白对照组无显著性差异(P＞0.05)，低剂量组与消银颗粒组无显著性差异(P＞0.05)，但仍高于正常对照组(P＜0.05)，见表2。

表2 对血清VEGF 水平的影响(±s)

表2 对血清VEGF 水平的影响(±s)

注:与正常对照组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＜0.01

组别 n VEGF(pg/ml)与消银颗粒组比较空白对照组 8 68.21±3.71b＜0.01模型组 8 111.29±6.16a＜0.01白疕高剂量组 8 72.14±2.98b＜0.01白疕中剂量组 8 75.99±2.98ab＜0.05白疕低剂量组 8 82.31±4.60ab＞0.05消银颗粒组 8 81.24±6.10 ab

3 讨论

中药白疕合剂为辽宁中医药大学附属医院积数十年治疗银屑病的临床经验而研制成的院内制剂，取得了确切满意的疗效，尤以进展期效果最为显著。课题组对该中药多角度进行了动物模型研究，以进一步明确该中药治疗银屑病的作用机制。

现在研究认为，银屑病表皮增生与cGMP/cAMP的比率增高有关［3］。环核苷酸cAMP 和cGMP 的调节对表皮细胞的生长和分化有重要意义。cAMP 通过激活磷酸化酶加速糖原代谢，从而抑制表皮有丝分裂，减慢转换率，并抑制细胞周期的进程，从而达到抑制细胞增殖的作用。cGMP 在表皮细胞的增殖、分化中也起一定的作用。它能促进表皮的增殖。cGMP 可以调节cAMP 的浓度及其信号通路，和cAMP 是人体对立的两种调节系统，在细胞增殖发动时，细胞内的cAMP 含量降低，cGMP含量增高。cAMP 抑制细胞生长繁殖，cGMP 则增强细胞繁殖。现在认为，银屑病表皮的增生不是简单的由于cAMP 减少和cGMP 增高，更重要的是cGMP/cAMP 的比率增高所致。

VEGF 又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，属于生长因子中的血小板衍生的生长因子家族之一。在众多血管生成因子中，VEGF 是唯一能特异性作用于血管内皮细胞的因子，是目前已知最强的促血管生成因子［4］。VEGF 的主要作用是促进血管内皮细胞增生，提高血管的通透性。银屑病的病理损害中经常有VEGF 及其受体表达的增高，这可能是银屑病发病中一些炎症反应及真皮乳头血管增生的分子基础［5］。银屑病患者皮损VEGF 增多，抑制患者VEGF 的生成可以用来治疗该病［6］。

本研究结果显示，中药白疕合剂可能通过提高血清中cAMP 含量、降低cGMP 含量、调节cAMP/cGMP 比值抑制银屑病表皮细胞增殖。通过降低血清VEGF 水平，从作用于微血管角度调节银屑病发病的部分炎症和免疫过程，取得疗效。下一步课题组会继续深入探讨该药对银屑病的其它免疫学机制的相关影响。

［1］郑敏.银屑病发病机制研究中若干问题的思考［J］.中华皮肤科杂志，2006，39(3):121-123.

［2］邵长庚.银屑病防治研究及合理治疗［M］.北京:中国协和医科大学出版社，2006:84.

［3］王侠生，廖康煌.杨国亮皮肤病学［M］.上海:上海科学技术文献出版社，2005:507.

［4］Dvorak AM，Feng D.The vesiculo-vaeuolar orsanelle(VVO).A new endothelial cell permeability organelle［J］.J Histoehem Cytoohem，200l，49(4):419-432.

［5］王刚，张开明.银屑病［M］.北京:人民卫生出版社，2005:71.

［6］Creamer D，Allen M，Jaggar R，et al.Mediation of systemic vascular hyperpermeability in severe psoriasis by circulating vascular en dothelial growth factor［J］.Arch Dermatol，2002，138 (6):791-796.