消微防石汤对大鼠肾脏草酸钙微结石防治作用及机制的实验研究

刘海华 张亚强 李永岚

目前研究的泌尿系结石主要是大到一定程度而能通过影像诊断出来的泌尿系结石，对于影像不能诊断出来的泌尿系微结石还缺乏研究［1］。李永岚主任检验师创建的早期尿石病诊断法［2］使影像诊断不出来的泌尿系微结石的诊断成为可能，张亚强教授结合泌尿系微结石特点及临床防治经验，拟创了消微防石汤用于治疗泌尿系微结石以防止其长成影像可见的泌尿系结石，临床实践证明疗效确切。本研究旨在通过动物实验观察消微防石汤对大鼠肾脏草酸钙微结石防治作用并初步探讨其防治机制，为消微防石汤防治泌尿系微结石的临床应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级健康雄性大鼠72 只，体重(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物生产许可证编号:SCXK(京)2012-0001，质量合格证单号:NO.11400700005691)，按4 只/笼饲养于公安部物证鉴定中心毒理学应用研究动物实验室。

1.2 药物、试剂及仪器

1.2.1 药物 消微防石汤(组方为金钱草30 g、鸡内金30 g、川牛膝20 g、芦根20 g、丹参20 g、陈皮12 g、乌药10、郁金20 g、茯苓10 g、炒白术20 g、肉桂3 g、萆薢20 g)由中国中医科学院广安门医院药剂科根据原方比例提供生药并经煎药室分别煎制成消微防石汤低、中、高剂量煎剂(分别相当于正常成年人日用量5 倍、10 倍、20 倍)，冷藏备用;复方金钱草颗粒(批号:120609)由广西万通制药有限公司生产，成份为金钱草、车前草、石韦、玉米须，每袋3 g(相当于生药4.9 g)，正常成人1～2 袋/次、3 次/天，按正常成人日用量(即4.5 袋/天)10 倍药量用开水溶化成复方金钱草颗粒溶化液，冷藏备用;0.9% 生理盐水注射液(生产批号:1307221351)由辰欣药业股份有限公司生产;乙二醇(批号:2013020128)由国药集团北京分公司生产。

1.2.2 试剂 尿液pH 试纸(标准代号:Q/HTZ07-2004)由杭州特种纸业有限公司生产。

1.2.3 仪器 T500 型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)，HG-9602A 氢化物内置原子吸收分光光度计(国产)，7150 全自动生化仪(日立)，OLYMPUS偏光显微镜(日本)。

1.3 分组、造模及给药

1.3.1 分组 将72 只Wistar 大鼠按随机数字表随机分成六组，设正常组(12 只)、生理盐水阴性对照组(12 只)、复方金钱草颗粒阳性对照组(12 只)、消微防石汤低剂量实验组(12 只)、消微防石汤中剂量实验组(12 只)、消微防石汤高剂量实验组(12 只)。

1.3.2 造模 将乙二醇用蒸馏水配制成一定浓度，各组大鼠适应性休息1 周后，除正常组外，其余各组均用一定量已配制好的乙二醇溶液灌胃，每天上午灌胃1 次，连续5 天。

1.3.3 给药 各组大鼠适应性休息1 周后，除正常组外，其余各组每天下午按9.62 ml/(kg·d)给予药物灌胃，连续5 天，即:生理盐水阴性对照组给予0.9% NaCl 注射液，复方金钱草颗粒阳性对照组给予复方金钱草颗粒溶化液，消微防石汤低、中、高剂量实验组分别给予低、中、高剂量消微防石汤。整个过程无大鼠死亡。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 取材 第5 天末次灌药后，各组均用代谢笼收集12 小时(20:00～8:00)尿液离心取清液并用pH 试纸测pH 值后放入－20℃冰箱待测其它指标，称各组大鼠体重，然后腹腔麻醉，采腹主动脉血离心取血清并放入－20℃冰箱待测，取肾组织称重后放入4%福尔马林固定。

1.4.2 肾组织观察 将肾组织制成肾纵行软组织定向切片，用偏光显微镜观察，根据快速草酸钙动物模型［3］五级分类法，按晶体有无、数量、聚合度和部位而分为(+ + +)、(+ +)、(+)、(±)、(－)，其中(－)级为成石阴性，(±)、(+)、(+ + )、(+ + +)级为成石阳性。

1.4.3 动脉血清及尿液草酸、钙、肌酐浓度测定将离心后的动脉血清及尿液送往上海恒远生物科技有限公司，采用原子吸收检测方法用HG-9602A氢化物内置原子吸收分光光度计(国产)检测草酸，采用比色检测法用7150 全自动生化仪(日立)检测钙、肌酐。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0 统计软件进行数据统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。表1完全随机设计多样本率计数资料，总体及组间两两比较均采用χ2检验;表2、3、4 完全随机设计多样本计量资料，以(±s)表示，总体及组间两两比较均采用非参数检验。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织成石程度比较

六组大鼠肾组织总体成石率比较，采用Pearson χ2检验，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义，说明六组大鼠肾组织总体成石率不全相同，表1中成石率由高到低依次是生理盐水阴性对照组(87.50%)、消微防石汤低剂量实验组(79.17%)、复方金钱草颗粒阳性对照组(70.83%)、消微防石汤中剂量实验组(58.33%)、消微防石汤高剂量实验组(50.00%)、正常组(0.00%);与生理盐水阴性对照组比较，复方金钱草颗粒阳性对照组采用Pearson χ2检验、消微防石汤低剂量实验组采用校正χ2检验，分别为P=0.155＞0.05、P=0.699＞0.05，差异均无统计学意义，消微防石汤中、高剂量实验组均采用Pearson χ2检验，分别为P=0.023＜0.05、P=0.005＜0.01，差异均有统计学意义;与复方金钱草颗粒阳性对照组比较，消微防石汤低、中、高剂量实验组均采用Pearson χ2检验，分别为P=0.505＞0.05、P=0.365＞0.05、P=0.140＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤高剂量实验组与中剂量实验组、中剂量实验组与低剂量实验组比较，均采用Pearson χ2检验，分别为P=0.562＞0.05、P=0.119＞0.05，差异均无统计学意义，高剂量实验组与低剂量实验组比较，采用Pearson χ2检验，P=0.035＜0.05，差异有统计学意义。(编者按:本χ2检验的两两比较，其检验水准P=0.05 未经校正，请读者斟酌看待。)

表1 大鼠各级成石肾组织个数

2.2 各组大鼠动脉血清草酸、钙、肌酐浓度比较

六组大鼠动脉血清草酸总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.956＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠动脉血清草酸总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.862＞0.05、P=0.751＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.908＞0.05、P=0.453＞0.05，差异均无统计学意义。六组大鼠动脉血清钙总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.317＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠动脉血清钙总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.453＞0.05、P=0.862＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.862＞0.05、P=0.564＞0.05，差异均无统计学意义。六组大鼠动脉血清肌酐总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.958＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠动脉血清肌酐总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.751＞0.05、P=0.564＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.954＞0.05、P=0.419＞0.05，差异均无统计学意义。

2.3 各组大鼠尿液pH、草酸、钙、肌酐浓度比较

六组大鼠尿液总体pH 值比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.436＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠尿液总体pH 值全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.251＞0.05、P=0.559＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.440＞0.05、P=0.518＞0.05，差异均无统计学意义。六组大鼠尿液草酸总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.896＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠尿液草酸总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.862＞0.05、P=0.729＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.525＞0.05、P=0.931＞0.05，差异均无统计学意义。六组大鼠尿液钙总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.800＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠尿液钙总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=1.000＞0.05、P=0.371＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.419＞0.05、P=0.583＞0.05，差异均无统计学意义。六组大鼠尿液肌酐总体浓度比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.853＞0.05，差异无统计学意义，说明六组大鼠尿液肌酐总体浓度全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.729＞0.05、P=0.840＞0.05，差异均无统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.435＞0.05、P=0.686＞0.05，差异均无统计学意义。

2.4 大鼠左、右肾重量及体重比较

六组大鼠左肾总体重量比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.047＜0.05，差异有统计学意义，说明六组大鼠左肾总体重量不全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.722＞0.05、P=0.005＜0.01，消微防石汤中剂量实验组差异无统计学意义，消微防石汤高剂量实验组差异有统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.787＞0.05、P=0.018＜0.05，消微防石汤中剂量实验组差异无统计学意义，消微防石汤高剂量实验组差异有统计学意义。六组大鼠右肾总体重量比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.007＜0.01，差异有统计学意义，说明六组大鼠右肾总体重量不全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.806＞0.05、P=0.024＜0.05，消微防石汤中剂量实验组差异无统计学意义，消微防石汤高剂量实验组差异有统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.926＞0.05、P=0.026＜0.05，消微防石汤中剂量实验组差异无统计学意义，消微防石汤高剂量实验组差异有统计学意义。六组大鼠终末体重总体重量比较，采用Kruskal-Wallis H 检验，P=0.000＜0.01，差异有统计学意义，说明六组大鼠终末体重总体重量不全相同;消微防石汤中、高剂量实验组与正常组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.005＜0.01、P=0.000＜0.01，差异均有统计学意义;消微防石汤中、高剂量实验组与生理盐水阴性对照组比较，均采用Mann-Whitney U 检验，分别为P=0.751＞0.05、P=0.008＜0.01，消微防石汤中剂量实验组差异无统计学意义，消微防石汤高剂量实验组差异有统计学意义。

表2 大鼠动脉血清草酸、钙、肌酐浓度(±s)

表2 大鼠动脉血清草酸、钙、肌酐浓度(±s)

组别 n 草酸(mg/L) 钙(mg/L) 肌酐(μmol/L)12 5.6469±1.3250 105.25±14.42 30.10±6.73生理盐水阴性对照组 12 5.4677±1.6211 99.92±19.74 29.67±6.31复方金钱草颗粒阳性对照组 12 5.7013±1.6768 119.96±25.89 30.75±7.01消微防石汤低剂量实验组 12 5.4901±1.1979 105.23±23.85 30.28±8.07消微防石汤中剂量实验组 12 5.5563±1.4839 100.56±13.84 29.55±6.58消微防石汤高剂量实验组正常组12 5.7461±1.3208 105.37±18.42 32.58±8.20

表3 各组大鼠尿液pH、草酸、钙、肌酐浓度(±s)

表3 各组大鼠尿液pH、草酸、钙、肌酐浓度(±s)

组别 n pH 草酸(mg/L) 钙(mg/L) 肌酐(μmol/L)正常组 12 6.8±1.0 28.3540±5.8202 50.33±9.97 11.45±3.42生理盐水阴性对照组 12 6.6±0.5 27.4761±8.3472 48.51±15.51 11.47±1.99复方金钱草颗粒阳性对照组 12 6.6±0.8 26.5220±8.8766 51.73±16.25 11.15±1.78消微防石汤低剂量实验组 12 6.2±0.7 27.4862±7.0634 48.45±10.91 11.03±1.76消微防石汤中剂量实验组 12 6.4±1.0 28.6484±7.2735 50.15±10.89 11.87±3.20消微防石汤高剂量实验组 12 6.5±0.8 28.0749±7.0557 48.12±12.59 11.91±2.09

表4 大鼠左、右肾重量及终末体重(±s)

表4 大鼠左、右肾重量及终末体重(±s)

组别 n 左肾(g) 右肾(g)终末体重(g )12 1.1±0.1 1.1±0.1 271±16生理盐水阴性对照组 12 1.1±0.1 1.1±0.1 251±17复方金钱草颗粒阳性对照组 12 1.1±0.1 1.1±0.1 251±23消微防石汤低剂量实验组 12 1.1±0.1 1.2±0.2 254±23消微防石汤中剂量实验组 12 1.1±0.1 1.1±0.1 250±16消微防石汤高剂量实验组__正常组12 1.0±0.1 1.0±0.1 228±18__

3 讨论

泌尿系结石是泌尿外科常见疾病，随着生活方式及饮食习惯等改变，全球发病率有增高趋势，一方面是因为结石的发生确实增加，另一方面是影像检查的普及使得更多无症状结石得以发现［4］。泌尿系结石成石机制尚未完全清楚［5］，如何预防泌尿系结石是值得逐步探讨和解决的命题，早期发现并积极治疗以防止结石继续长大是目前泌尿系结石预防的可行举措。

中国中医科学院广安门医院刘猷枋教授认为气滞血瘀是泌尿系结石病机之一，治疗时主张行气破血，拟创的化瘀尿石汤［6］用于治疗影像可见的泌尿系结石，二十多年临床与实验验证其疗效确切。李永岚老师创建了早期尿石病诊断法，通过偏光显微镜能检查出影像检查不出来的泌尿系微结石，使得泌尿系微结石早期发现成为可能。治未病是中医药优势，张亚强教授认为治疗泌尿系微结石病时应标本同治，去标而不伤正，顾本而重脾肾，结合多年临床经验拟创了消微防石汤，清热祛湿利尿兼以行气活血以加强排石之功，同时佐以健脾祛湿、益肾化浊以标本兼顾，实践证明其能有效促使泌尿系微结石排出以防止其继续长大成影像可见的泌尿系结石。

消微防石汤由金钱草、鸡内金、川牛膝、芦根、丹参、陈皮、乌药、郁金、茯苓、白术、肉桂、萆薢12 味中药组成，在清热祛湿、利尿排石基础上加予行气活血、健脾益肾;复方金钱草颗粒由金钱草、车前草、石苇、玉米须4 味清热祛湿、利尿排石药组成，选其作为消微防石汤阳性对照组。消微防石汤中、高剂量实验组成石率分别低于复方金钱草颗粒阳性对照组12.50%、20.83%，与复方金钱草颗粒阳性对照组比较，消微防石汤低、中、高剂量实验组差异虽然均无统计学意义(三组均P＞0.05)，但与生理盐水阴性对照组比较，复方金钱草颗粒阳性对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，而消微防石汤中、高剂量实验组差异均有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)，故可说明中、高剂量消微防石汤防治大鼠肾脏草酸钙微结石作用确切且较复方金钱草颗粒好，治疗泌尿系微结石病应在清热祛湿、利尿排石时兼以行气活血、健脾益肾。

有学者对单味中药或中药方剂防治泌尿系结石作用机制作了些研究。如金钱草、石苇、车前子是治疗泌尿系结石常用药，有研究证实单味中药金钱草、石苇、车前子均可增加大鼠尿中草酸钙晶体排出，对预防大鼠肾结石形成均有确切效果［7］;复方金钱草颗粒是治疗泌尿系结石常用中成药，有人研究发现复方金钱草颗粒可以增加大鼠尿量、减轻输尿管张力、抗炎及保护肾功能［8］。本研究显示，六组大鼠动脉血清与尿液中肌酐总体浓度均无显著性差异(P＞0.05)，可能由于肾脏草酸钙微结石程度较轻而尚未明显影响肾功能，故肌酐总体浓度无差别。消微防石汤中、高剂量实验组分别与生理盐水阴性对照组比较，成石率差异均有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)，而消微防石汤中、高剂量实验组大鼠尿液pH值及动脉血清与尿液中草酸、钙浓度与正常组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，与生理盐水阴性对照组比较，差异亦均无统计学意义(P＞0.05)，说明中、高剂量消微防石汤可能不是通过影响大鼠尿液pH 值及动脉血清与尿液中草酸、钙浓度以致影响草酸钙晶体的形成来发挥对大鼠肾脏草酸钙微结石的防治作用，其作用机制有待进一步探讨，有可能是通过影响草酸钙晶体的附着、排出而使肾组织草酸钙晶体减少。

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