贝母属植物的分类鉴定方法研究进展

梁孝祺 陈金金 俞超 盛梦俊

贝母属Fritillaria 是百合科Liliaceae 中的一个大属，主要分布于北半球的温带地区，常以干燥的鳞茎入药，具有清热润肺、止咳化痰的功效。近年来，大量的贝母新种和变种被发现，保守估计已被发现的贝母属物种超过80 种，变种超过50 种［1］，但在临床处方上通常仅将川贝母与浙贝母两大类进行区分，或是通过中医所称的6 个道地产区进行划分:伊贝母、川贝母、平贝母、湖北贝母、浙贝母及皖贝母。贝母是典型的多基原药材，如川贝母，在《中华人民共和国药典》(一部)中将卷叶贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母统称为川贝母，而后又加入瓦布贝母和太白贝母［2］。贝母的多基原性和庞大的物种基数，给其在流通、育种过程中的物种鉴定带来了困难。本文就贝母属药用植物的分类鉴定方法进行了分析整理，就形态学、化学成分多样性、分子标记等方面对贝母属鉴定方法作一综述，并比较不同方法的优缺点。

1 形态学鉴定

形态学鉴定是中药材最基本的鉴定方法，通过对药材植株的形态特征及其外观的显微特征存在的差异来鉴别不同的药材。但是仅仅通过植株外形进行鉴别，难以判断受到环境影响造成植物发育上的差异，且在近缘植物中往往缺乏足够明显的不同点。

随着显微技术的发展，通过花粉形态和淀粉颗粒形态鉴定贝母属药材成为主流，1996年罗毅波等［3］通过花被片、花药、花粉表面纹饰等特性的分析，对中国横断山区及临近地区及长江中下游地区的贝母属植物进行了分类学修订，对暗紫贝母Fritillaria unibracteata、天目贝母Fritillaria monantha、浙贝母Fritillaria thunbergii 中的部分物种进行了归并。2002年何斜［4］则通过淀粉颗粒的直径、脐点形状、气孔等特征成功对五大贝母类群进行了区分，明确区别了浙贝母、川贝母、平贝母和伊贝母四种常见药用贝母。濮祖茂等［5］对植物叶表面扫描电镜观察，对云南贝母属药用植物川贝母Fritillaria cirrhosa、梭砂贝母Fritillaria delavayi 等进行了聚类分析，确定了不同贝母叶表面的特征具有差异性，也可作为聚类分析的依据。

2 化学成分多样性鉴定

不同种类的药材，其化学成分必然存在差异，而同种药材，其主要成分的含量也存在差异。通过薄层色谱法、高效液相色谱法、热分析法及红外光谱法等，对不同贝母的化学成分差异进行分析，进而对其进行区分。

肖培根等［1］在贝母亲缘学研究中列举了从29类贝母属植物中分离鉴定出的120 多个生物碱，并指出了不同贝母所含生物碱种类和含量的差异。如浙贝甲素、浙贝乙素及西贝素在不同贝母中存在典型性的差异，西贝素仅存在于高海拔西部地区如四川、甘肃、新疆等产地的川贝母、康定贝母、伊贝母等，而浙贝甲素、浙贝乙素仅存在于东南部低海拔地区产地的浙贝母、安徽贝母、湖北贝母等［6］。

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是目前主流的贝母化学成分多样性鉴定方法，其利用不同化合物在流动相中的移动速度不同这一特点，通过色谱柱对液相中的化合物进行分子水平的分离，并形成对应分离时间的不同化合物信号强度峰图，以此比对不同贝母化学成分(主要是生物碱)种类及含量的差异。王聪等［7］在对川贝母的HPLC 指纹图谱研究中发现了川贝母复合群的成分指纹具有共同特征，并直观区别了川贝母复合群与浙贝母。但蔡晓翠等［8］通过HPLCELSD 指纹图谱对10 批不同种植区的伊贝母进行的研究发现，10 批伊贝母色谱峰图谱整体特征相似度高，但伊犁不同产区伊贝母中西贝母碱含量有明显差异，即使是同一产区，不同时期采集的伊贝母西贝母碱含量也有差异。液相色谱法的缺点即是难以排除自然环境、栽培方法等对植株化学成分及含量的影响。针对这一影响特点，周建良等［9］运用快速液相色谱(rapid resolution liquid chromatography，RRLC)分析了不同产地浙贝母的主成分特征图谱，强调了在高度精确的定量分析基础上各药材之间化学成分及含量上的差异，不仅能作为不同贝母品种的区分依据，还为区分同种药材产地和采收季节及药材的规格、品级提供了快速直观的定量数据支持。

2.2 其它生化鉴定方法

为解决HPLC、薄层色谱法等分析技术操作繁琐，分析周期长的问题，杨复森等［10］将便携式近红外光谱仪运用到了贝母属中药鉴定中，在对川贝母的种群识别、不同基原品种的定性分析和混伪品的鉴别中均取得了理想的效果，且大大降低了实验流程消耗的时间和成本。陈效忠等［11］则运用操作简单、价格低廉的电化学振荡技术，通过电化学指纹图谱反映药材整体化学成分的差异，成功区分川贝母、平贝母和浙贝母等药材，为中药材的快速鉴定提供了新思路。

3 分子标记鉴定

从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA 序列上的差异，而且这种差异不受环境和个体差异的影响。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学技术不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，应用分子标记技术鉴定中药基原植物及饮片取得了快速发展。

3.1 随机扩增多态性DNA 标记技术

随机扩增多态性DNA 标记(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术兴起于1990年，是基于RFLP 技术的第二代分子标记技术，具有操作简单，成本低廉的优势。其运用随机合成的短序列引物(8-12bp)以基因组DNA 为模板进行扩增，由于其DNA 上发生碱基的插入、缺失而使随机引物无法结合，从而使产生的DNA 图谱呈现多态性。该技术的特点是不需要基因探针，即使是完全未知的序列，也能扩增出多态性片段。

2009年，陆含等［12］运用RAPD 技术对浙贝母4个品种及5 种贝母属药材进行了分析。根据多态性片段分析结果，将4 个浙贝母品种聚类在一起，而5种贝母属药材中，浙贝母的变种—东贝母与浙贝母最为接近，伊贝母与浙贝母关系最远，其结果与传统分类学相符。龚伯奇［13］则通过RAPD 技术对青海省四个地区的暗紫贝母遗传多样性进行分析，获得的多态性信息准确地将每个样地的样品聚类在一起，并强调了RAPD 技术在种下等级的鉴定效力。在鉴定的稳定性方面，周洁［14］运用RAPD 标记和ISSR 标记对12 个浙贝母品种进行了分子鉴定，区分了磐安本地种植的贝母和引种贝母类群，并发现RAPD 的聚类结果与ISSR 标记得到的聚类结果基本一致，肯定了RAPD 技术的鉴定准确性。

3.2 简单重复区间标记技术

简单重复区间标记技术(inter-simple sequence repeat，ISSR)是对SSR 技术进行改进后的新型分子标记技术，又称为微卫星—锚定PCR 技术。DNA 在复制及修复过程中DNA 的滑动和错配，或者减数分裂期间姐妹染色单体的不均等交换均会产生简单重复区间(simple sequence repeat，SSR)，这些区间的两端多为保守的单拷贝序列，且SSR 在整个基因组中分布较为均匀，在不同品种间变异广泛。ISSR 技术以SSR 序列为引物并在3’端或者5’端加上2～4个随机核苷酸，PCR 过程中使锚定引物引起特意位点的退火，使重复序列间DNA 片段成功扩增。由于不同物种和品种的SSR 在基因组中的位置和数量均有差异，故扩增结果将表现出多态性［15］。刘晓贤等［16］运用ISSR-PCR 技术，对8 个浙贝母居群、1 个东贝母居群、1 个皖贝母居群和2 个川贝母居群进行聚类分析，发现磐安地区的浙贝居群已明显区别于其他产区浙贝居群，并且长期的留种栽培使磐安浙贝遗传多样性水平降低，形成相对稳定的遗传。王果平等［17］同样通过ISSR 技术，对新疆贝母属遗传多样性进行了聚类分析，将十种贝母分为三个类群。结果显示，大白花贝母、小白花贝母、黄花贝母和托里贝母聚类在了一起，这与罗毅波等［3］提出观点相吻合，对于戈壁贝母的分类也和前人的研究结果一致。

虽然ISSR 兼具了RAPD 的简便性和SSR 的稳定性，但对于反应体系的要求较为严格，赵鑫等［18］研究了TagDNA 聚合酶用量、dNTP、引物和Mg2+浓度四种因素对伊贝母ISSR-PCR 扩增的影响，确定了适于伊贝母ISSR 的反应体系，这对其他贝母属药用植物的ISSR 反应体系建立有指导作用。

3.3 DNA 条形码技术

DNA 条形码技术(DNA barcode)通过选取普遍性高且在种内遗传较为稳定但种间进化速率较快的DNA 序列，设计相应的引物，通过PCR 技术扩增出待鉴定物种的对应DNA 片段序列，通过直接测序的方法获得序列信息，运用MEGA 等软件比对序列信息，便能对其进行物种鉴定和系统发育构件，具有操作简单，鉴定效率高，重复性强，不受样品个体差异和环境影响等优点［19］。陈士林等［20］在对2373份药材样品的研究基础上，提出了以核基因ITS2 序列为核心叶绿体基因psbA-trnH 序列为辅的中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则，ITS2 序列是作为贝母属药用植物条形码鉴定的理想序列。在对贝母属的近缘属——重楼属的研究中，朱英杰等［21］对psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK 和核ITS2 序列的PCR 扩增成功率和鉴定效率进行了对比，发现ITS2序列鉴定效果最好，在29 个物种67 份样品中的鉴定效率为100%，可将中国大部分重楼属物种准确区分开来，且在种内几乎不存在差异。

基于ITS2 序列在百合科部分属中的成功应用，罗焜等［22］同样运用ITS2 序列对川贝母及其混伪品进行了鉴定。其结果表明，ITS2 序列能准确区分川贝母基原植物与其混伪品，并将六种不同的川贝母基原植物:卷叶贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭沙贝母、太白贝母、瓦布贝母聚类在一起，验证了药典的正确性。另外，系统发育树显示，川贝母、甘肃贝母、梭沙贝母的多个样品呈多物种交错状，推测其川贝母复合群可能是处于激烈分化的物种形成阶段，一些种下等级在不同地区，植物形态和花部特征出现差异，而被划分为不同物种，此推论与肖培根等［1］的讨论相符。

3.4 其它分子标记技术

表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)技术，是利用逆转录酶，对编码蛋白质的mRNA 进行逆转录，构建物种cDNA 文库，并对文库中的克隆进行大规模测序，通过ESTs 图谱区分基因水平的差异。目前，在川贝母的cDNA 文库中，已有超过2158 条高品质的ESTs 序列信息，和超过1343 个独特的转录组［23］。现已发现包括HMGR、CYP450s、FPSs 和氨基酸转移酶在内的数十个川贝母生化活性相关的转录集合，这为进一步研究贝母甾体生物碱合成相关的转录组基因鉴定技术提供了技术支持。ESTs 序列还有望用于探究同源基因在保守物种之间进化水平的差异，是潜在的系统发育标记［24］。

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技术是建立在RFLP 技术基础上的一种新型分子标记技术，利用EcoRI、PstI 及SacI 等限制性内切酶切割基因组DNA，形成酶切位点不同、分子量大小不等的随机性酶切片段，在其两端接上双链人工接头后，进行PCR 扩增，电泳后获得具有多态性的指纹图谱。徐金中等［25］运用AFLP分析了浙江主产区浙贝母的种质遗传多样性，发现AFLP 技术在不同产地浙贝母中具有丰富的遗传多样性，其聚类关系也与产地有明显的关联性。在地理位置上较近的东阳、磐安、永康、缙云产地的贝母遗传距离同样较近，而浙贝母最初的产地象山浙贝母居群与其他居群相对独立，这进一步表明象山浙贝母居群遗传基因较为保守，与其他迁徙居群形成明显差异。

4 总结及展望

综合大量研究结果，对各种方法进行了总结分析，其不同鉴定方法的优缺点如表1所示。

在对不同方法的比较中，肖培根、罗焜等均认为，从基因角度入手，深入到遗传物质遗传分化的研究对贝母属以及其它药用植物的鉴定具有准确、稳定、可重复的优势。而DNA 条形码技术，是现阶段内非常适合作为药用植物大批量快速鉴定的技术，其条形码序列ITS2 片段，存在于细胞核中，适用于贝母鳞茎干片、粉末等市场流通样品的鉴定，鉴定效果理想［22，31］。系统化、标准化的DNA 条形码鉴定技术能够贯穿中药材种植、加工、生产、流通等各个环节，实现对中药材基原物种、粉末、组织等材料来源的快速鉴定［20］，在生物物种监管、药材市场管理、生物多样性及系统进化研究等方面有着巨大的潜在作用，能很好地解决贝母市场鱼龙混杂，各个相似品种间以次充好的现象。

综上所述，对于贝母属植物以及其它中药材的鉴定，无论是生化标记还是分子标记，都走向一个数据收集、数据库构建的过程，在新技术方面，期望随着生物技术的发展，ESTs 技术、系统生物学、SNP技术和基因芯片技术能为贝母属药用植物研究提供有力帮助［32］。

表1 在贝母属中不同鉴定方法的优劣分析

［1］肖培根，姜艳，李萍.中药贝母的基原植物和药用亲缘学的研究［J］.植物分类学报，2007，45(4):473-487.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010.

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［4］何斜.中药贝母的品种与性状区别［J］.海峡药学，2002，14(6):55-57.

［5］濮祖茂，丁侃，苏宝亮.云南贝母属药用会务叶表面扫描电镜观察［J］.电子显微学报，2001，20(1):11.

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