消渴康对糠尿病肾病大鼠肾脏基质金属蛋白酶9与蛋白酶组织抑制剂1表达的影响

李梦 李凤婷 耿建国

糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症，也是导致糖尿病患者致残致死的主要原因之一，而细胞外基质(extracellu-lar matrix，ECM)进行性积聚是糖尿病肾病发展过程中最基本的病理损伤［1］。生理状态下，ECM 产生和降解处于机体精确调控下，起到支持、连接组织结构等生理作用。但糖尿病肾病时，糖代谢紊乱及其所引发的血流动力学改变、细胞因子释放、信号通路开放、组织酶调节等多种因素综合作用使ECM 动态平衡被打破，生成增加而降解减少，导致ECM 进行性积聚，进而引发并加剧糖尿病肾病［2-5］。本课题组之前的实验已证实消渴康能够有效抑制糖尿病肾病时肾组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinasse，P38MAPK)表达从而明显降低ECM 的产生［6-8］，而自拟消渴康是否也对ECM 降解产生影响尚不清楚。MMP-9 和TIMP-1 是影响ECM 降解的重要组织酶之一，在糖尿病肾病形成和发展过程中，MMP-9 降低与TIMP-1 升高可导致ECM 异常积聚。本实验通过观察消渴康对糖尿病肾病大鼠肾组织MMP-9 与TIMP-1 表达，从另一方面探讨其对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用，现将研究报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SD 雄性大鼠48 只，体重160～180 g，鼠龄2～3月龄，购自首都医科大学实验动物科学部。

1.2 药物和试剂

消渴康(生黄芪30 g、葛根30 g、决明子10 g、薏苡仁30 g、丹参10 g)汤剂，根据耿建国教授临床经验自拟，药材购自北京祥威药业公司;氯沙坦甲片，商品名科素亚，购自杭州默沙东制药有限公司生产，批准文号为“国药准字H20000371”，规格50 mg/片;链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)，购自美国Sigma 公司;免疫组化试剂盒，购自美国abcam 公司。

1.3 仪器

LEICA 数字显微照相机，NIS-Elements Basic Research 图像采集分析系统。

1.4 造模

10%水合氯醛(0.35 ml/100 mg)腹腔麻醉后切除右侧肾脏。术后2 周，腹腔注射STZ(50 mg/kg)。72 小时后，尾静脉采血，当血糖浓度≥16.7 mmol/L，尿糖定性＞+ + +，确定糖尿病肾病造模成功。

1.5 分组及给药

将造模成功动物随机分为正常组、模型组、氯沙坦组(5.2 mg/kg·d)、消渴康小剂量组(6.3 g/kg·d)、消渴康中剂量组(12.6 g/kg·d，)，消渴康大剂量组(25.2 g/kg·d)，每组8 只。连续灌胃12 周，每天1次，正常组、模型组每日灌服等量蒸馏水。

1.6 取材

药物干预后第4、8、12 周末，眼眶下静脉丛取血2 ml。离心取血清，用全自动生化仪测定肾功能。药物干预第12 周末，处死大鼠，取出肾脏，去被膜，Bouin 液固定，常规制片。

1.7 观察指标

免疫组化法检测MMP-9 和TIMP-1 表达情况，每组采集10 个40 倍随机视野，作积分光密度统计。

1.8 统计学处理

对于各组数据采用单因素方差分析，并作组间两两比较，P＜0.05 为差异有统计学意义，统计分析软件使用SPSS 13.0。

2 结果

2.1 MMP-9、TIMP-1 在肾组织表达情况

MMP-9 显色为棕黄色染色颗粒，主要分布在肾小管上皮细胞中，在肾小球上有散在分布。与正常组比较，模型组MMP-9 显色明显减弱，而消渴康小剂量组显色则明显加强，见图1;TIMP-1 显色为棕黄色染色颗粒，主要分布在肾小管上皮细胞中，在肾小球上有散在分布。与正常组比较，模型组、氯沙坦组、消渴康大剂量组显色均明显加强，消渴康中剂量组、消渴康小剂量组未见明显加强。与模型组比较，消渴康中剂量组、消渴康小剂量组显色明显减弱，见图2。

2.2 MMP-9、TIMP-1 积分光密度比较

各组数据采用单因素方差分析，并作组间两两比较。MMP-9 结果比较:与正常组比较，模型组、氯沙坦组、消渴康大剂量组、消渴康中剂量组均显著性降低;与模型组比较，氯沙坦组极显著性降低(P＜0.05);与氯沙坦组比较，消渴康三剂量组均极显著性增高(P＜0.01)。TIMP-1 结果比较:与正常组比较，模型组、氯沙坦组、消渴康大剂量组均显著性增高(P＜0.05);与模型组比较，消渴康中剂量组、消渴康小剂量组均极显著性降低(P＜0.01);与氯沙坦组比较，消渴康小剂量组极显著性降低(P＜0.01)。MMP-9/TIMP-1 结果比较:与正常组比较，模型组、氯沙坦组、消渴康大剂量组均极显著性降低(P＜0.01);与模型组比较，消渴康中剂量组、消渴康小剂量组均显著性升高(P＜0.05);与氯沙坦组比较，消渴康中剂量组、消渴康小剂量组均显著性升高(P＜0.05)，具体见表1。

3 讨论

肾脏ECM 合成与降解通常处于动态平衡之中。糖尿病肾病时，高糖作用下ECM 合成与降解的动态失衡是导致肾脏ECM 进行性积聚的主要原因［9］。Ⅳ型胶原是ECM 的主要成分，而MMP-9 是Ⅳ型胶原的主要降解酶之一，TIMP-1 是MMP-9 特异性的抑制剂。MMP-9 与TIMP-1 的共同作用对Ⅳ型胶原的降解起到重要调节作用。糖尿病肾病时，正是由于MMP-9 表达减少与TIMP-1 表达增加，导致MMP-9/TIMP-1 下降，从而使得Ⅳ型胶原降解减少，ECM成分稳定增高，ECM 合成与降解间动态平衡被打破，最终使糖尿病肾病逐渐向深层次发展［10-12］。

图1 肾组织MMP-9 免疫组化染色(40 ×10)

图2 肾组织TIMP-1 免疫组化染色(40 ×10)

表1 各组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 积分光密度比较(±s)

表1 各组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 积分光密度比较(±s)

注:与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01;与氯沙坦组比较，eP＜0.05，fP＜0.01。

组别 n MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1正常组10 6.21±1.63 1.10±0.34 6.03±2.23模型组 10 4.38±0.73b 3.21±2.15b 1.93±1.24b氯沙坦组 10 2.54±0.65bd 2.23±1.34a 1.41±0.65b消渴康大剂量组 10 4.40±1.12bf 2.17±0.81a 2.27±0.9b消渴康中剂量组 10 4.80±1.04af 1.52±0.92d 4.27±2.3ce消渴康小剂量组 10 6.98±1.93df 0.70±0.35df 11.60±4.97 bdf

本实验针对糖尿病肾病正虚邪实、虚实互见的病机特点，采用消渴康对糖尿病肾病大鼠进行药物干预。其中，葛根与生黄芪同用，益气养阴、生津止渴、扶助正气，正气恢复则抗邪有力，有利于驱除邪气;生薏苡仁、决明子与丹参同用，利湿祛浊、活血祛瘀、攻逐邪气，邪气蠲除则消除邪气对正气的危害，有利于正气的恢复。诸药合用，扶正祛邪，具有益气养阴、利湿化浊、活血化瘀的作用，与糖尿病肾病病机十分符合。

本课题组先前的实验研究已证实消渴康能够有效抑制糖尿病肾病时肾组织TGF-β1、P38MAPK表达，从而抑制ECM 的生成，有效的保护了肾脏微观结构，改善肾功能异常。而本实验结果又证实消渴康能够显著提高糖尿病肾病大鼠肾组织MMP-9表达(消渴康小剂量组，P＜0.01)，降低TIMP-1 表达(消渴康小剂量组、消渴康中剂量组，P＜0.01)，有效加强ECM 降解，从而抑制ECM 在肾脏积聚。由此可见，消渴康对于糖尿病肾病的保护作用很可能是通过有效抑制肾脏ECM 异常积聚、维护肾脏微观结构而实现的，而消渴康对ECM 异常积聚的抑制作用不仅表现在降低ECM 合成，同样表现在增强ECM 降解上，从而具有较好的抑制ECM 积聚作用，最终起到保护糖尿病肾病肾脏功能、延缓糖尿病肾病发展的作用，为后期临床研究提供了一定的参考依据。

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