中成药大黄蛰虫丸的宏条形码基原鉴定*

田晓轩，刘 杰，窦永杰，赵亚楠，吕朝耕，张春晖，朱 彦

（天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室（培育），天津 300193）

·中药研究·

中成药大黄蛰虫丸的宏条形码基原鉴定*

田晓轩，刘 杰，窦永杰，赵亚楠，吕朝耕，张春晖，朱 彦

（天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室（培育），天津 300193）

[目的]探索应用宏条形码方法进行复方中成药基原鉴定分析的可行性。[方法]磁珠法提取中药大黄蛰虫丸DNA，以16S、trnL及Mini-barcode为靶标进行荧光定量PCR。产物经克隆测序拼接后，经BLASTn比对，用MEGAN软件进行分类单元解析，对虻虫来源序列应用MEGA软件进行遗传分析。[结果]从23条单克隆测序结果中解析到蛴螬、虻虫、甘草及桃仁或苦杏仁等中药成分，对虻虫6条序列分析，显示其源于3组遗传差异较显著的个体。[结论]宏条形码技术可用于中成药成分的鉴定，可作为中成药质量评价的潜在工具。

中成药；大黄蛰虫丸；宏条形码；分类单元匹配；遗传分析

中药的基原鉴定是中药研究的基础工作，其方法包括较传统的原植物（原动物）鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等。除此以外，分子鉴定特别是DNA条形码鉴定近年来发展迅猛，已构建了关键性基础数据库，如MMDBD数据库[1]及中国医学科学院药用植物研究所建立的中药DNA条形码数据库，形成了中药DNA条形码鉴定的规范流程[2-3]。

以上研究多以单独的中药饮片为对象，对于以复方中成药为例的复杂体系，药物基原的分子鉴定尚开展较少。较为相关的一项工作中，研究者以叶绿体trnL及核糖体16S为靶标基因，从若干中成药中提取DNA，结合DNA条形码理论与高通量测序技术（即宏条形码metabarcoding技术）进行药物基原检测。该研究主要关注中药中濒危保护动物以及潜在有毒生物成分的鉴别[4]，而从中药生产实践的角度看，宏条形码技术既可用于药物成分的真伪鉴定，也可通过其所揭示的参与成药生物的遗传多样性，提供种质层面的中药质量评价手段。

本实验所试样品大黄蛰虫丸，源于汉代张仲景《金匮要略》方，主要成分为土鳖虫（炒）、水蛭（制）、虻虫（去翅足，炒）、蛴螬（炒）等4味动物药及熟大黄、干漆（煅）、桃仁、苦杏仁（炒）、黄芩、地黄、白芍、甘草等8味植物药。在2010年版《中国药典》中，质量控制成分均为植物来源。本研究以该药为材料，探索宏条形码思路用于复方中成药基原鉴定分析的可行性。

1 材料与方法

1.1 中成药样品DNA抽提 受试药品大黄蛰虫丸（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂），生产批号为4130023，生产日期2012年5月19日，2013年5月15日购买于天津老百姓大药房。后存储于4℃冰箱内。该药品为大蜜丸剂，每丸3 g。

取丸药100 mg，使用磁珠法动物基因组试剂盒（生工生物）抽提DNA。加入400 μL Buffer MACL，200 μL Buffer MCL，以及终浓度1 mg/mL的蛋白酶K（生工生物）、1%巯基乙醇（生工生物），于55℃震荡过夜。消化后样品经12 000 g离心5 min，取约500 μL上清液至新的离心管。磁珠法反复纯化两次，最终获得60 μL DNA样品。

经Nanodrop 2000测试，样品260 nm光吸收值为46.74。260 nm/230 nm为0.789，260 nm/280 nm为1.525，提示样品污染仍较为严重，以260 nm光吸收值估算DNA浓度不可靠。

1.2 实时定量PCR及测序分析 实时定量PCR仪为Bio-Rad CFX96。实验所用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒购自全式金公司，扩增动物中的通用分子标记线粒体16S核糖体RNA（rRNA）基因[5]，植物中的通用分子标记叶绿体trnL基因[6]，以及在真核生物（侧重动物）中的通用分子标记线粒体细胞色素氧化酶COI基因5’端约130 bp的片段（即Mini-barcode）[7]。实验所用引物由金唯智公司合成，引物信息见于表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

因样品DNA真实含量未知且可能存在PCR反应抑制物质，样品的梯度稀释液（原液、1/10及1/100）被用于实时定量PCR反应。反应体系25 μL，模板上样量1μL。PCR条件为94℃5 min，随后进行40个循环的94℃变性30 s，退火30 s以及72℃延伸30 s，进行熔解曲线分析后72℃10 min补齐末端。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认产物大小。本实验以初步探索宏条形码技术中药鉴定能力为目的，不必需深度测序。考虑到单次二代测序成本较高，故PCR产物经pMD-18T（Takara）-感受态细胞常规克隆后，挑取单菌落送金唯智公司Sanger法双向测序，测序结果用BioEdit7.2.5软件拼接整理。

1.3 BLASTn-MEGAN分类单元解析及MEGA遗传分析 测序结果经National Centre for Biotechnology Information（NCBI）在线BLASTn 2.2.29+搜索比对。搜索参数中设置Match分数为1，Mismatch分数为-2，Gapcosts为0，Low Complexity Filter为“Yes”，Expect value为10，Hitlist size为100。搜寻对象为NCBI GenBank nucleotide nr/nt数据库，数据库发布时间为Jan 3,2014 4:14 AM。

将 BLASTn结果输入宏基因组分析软件MEtaGenome Analyzer（MEGAN）version 5.1.5[8]，根据最低共同祖先算法 Lowest Common Ancestor（LCA）进行扩增产物的分类单元解析，寻找能匹配到的最低分类单元。MEGAN分析参数设置，min score为65，top percent为5，min support为1。结合药典规定的中药基原，判断各条序列源于何种中药。

针对感兴趣的中药品种，使用分子遗传分析软件MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis（MEGA）version 6.06[9]，应用Kimura-2距离法模型计算序列间的遗传距离并做系统发育分析，Bootstrap值为1 000。

2 结果

2.1 实时定量PCR结果 在40个循环内，以大黄蛰虫丸DNA的原液及1/10稀释液为模板的PCR反应，均无起飞的扩增信号。以1/100稀释液为模板，16S1F/2R扩增的Ct值为20.32，trnL c/h扩增的Ct值为15.43以及Mini-barcode扩增的Ct值为30.12（软件自动确定的单一阈值为1.71）。考察扩增产物的熔解曲线，16S1F/2R扩增产物的Tm值为72℃，trnL c/h扩增产物的Tm值为77℃。Mini-barcode扩增产物的熔解曲线为多峰，非特异PCR反应情况较严重。

2.2 克隆测序及序列比对 Mini-barcode产物常规克隆失败。16S1F/2R经克隆后送12个单克隆双向测序，测序结果去除引物后，经Clustal W比对（缺省参数），如图1所示。trnL c/h送11个单克隆测序，整理方法同上，结果见图2。

图1 16S1F/2R克隆测序结果Fig.1 Sequences of 16S1F/2R PCR products

图2 trnL c/h克隆测序结果Fig.2 Sequences of trnL c/h PCR products

2.3 序列的分类单元解析及遗传距离分析 测序结果经BLASTn比对后，经MEGAN分析，将匹配结果展示至属级分类单元，如图2所示。共有19条序列成功匹配。其中16S来源序列匹配于全变态类昆虫Endopterygota，2条序列匹配到鞘翅目多食亚目Polyphaga（T0035）及其下的金龟子科Anomala属（T0054），即中药蛴螬（金龟子科幼虫）；6条序列匹配于虻虫亚科Tabaninae（T0033，T0037，T0053）及其下的 Cydistomyia属（T0032）和虻属 Tabanus（T0050，T0051），即中药虻虫。trnL来源序列全部匹配于豆类植物（fabids），1条序列匹配于甘草属Glycyrrhiza（T0048），即中药甘草；10条序列匹配于李属Prunus，即中药桃仁或苦杏仁（T0026-T0031，T0045-T0047，T0049）。

图3 MEGAN分类单元匹配结果Fig.3 Taxonomy assignments by MEGAN

本研究共得到6条匹配于虻虫的单倍体序列。因16S序列为母系遗传线粒体基因，一般的，每一单倍体序列代表至少一个“虻虫”个体。计算其相互间遗传距离可知，T0033与T0053，T0050与T0051间遗传距离（D=0.006，S.E.=0.006）远小于平均值（D=0.065，S.E.=0.014）。将T0033与T0053，T0050与T0051成组，T0032及T0037单独成组，经遗传分析发现，T0033&T0053组与T0050&T0051组间距离（D=0.036，S.E.=0.016）仍小于其他组间距离，详见

图4 代表虻虫六条序列（OTUs）间的系统发育树Fig.4 Phylogenetic analysis of sequences（OTUs）that representing TCM Mengchong

表2 代表虻虫的6条序列间及组间遗传距离（Kimura-2 model，Bootstrap=1 000）Tab.2 Genetic distances between sequences(groups)that representing TCM Mengchong（Kimura-2 model，Bootstrap=1 000）

3 讨论

本实验从约 1/30颗大黄蛰虫丸药中提取DNA。经PCR、Sanger测序及生物信息学分析，鉴定出蛴螬、虻虫、甘草及桃仁或苦杏仁等中药。因测序通量较低（相对于高通量测序的百万级测读通量），且部分药物DNA受炮制影响可能降解，未能鉴定到所有方剂成分。本实验所用分子标记16S及trnL具有序列较短易于扩增的特点，被优先用于宏条形码研究[4]。但其并非中药DNA条形码研究主流分子标记，参考数据集相对不完整且解析力不足。下一步考虑开发合适的分子标记片段，立足于已基本完善的中药DNA条形码数据库，进行复方中成药的鉴定研究。

商品化中药饮片常见伪劣品[10-11]，而以虻虫为例的许多动物类饮片更存在着基原混伪，来源复杂的问题[12-15]，且生产使用中质量评价手段缺乏。本鉴定方法对此类缺乏化学特征标记的动物基原具有优势。本项研究中，软件MEGAN将序列T0032解析为源于虻亚科全绿虻族Diachlorini的Cydistomyia属。但目前尚未见全绿虻族在中国的分布报道[16]，同时因虻亚科参考数据的限制，尚不能认为T0032确属全绿虻族，但确可认为存在至少三类遗传差异较大的虻虫个体用于该药丸的生产。2010版中国药典规定虻科昆虫复带虻Tabanus bivittatus为虻虫药材的原动物。但此拉丁名为双斑黄虻旧名，且该品种在药材市场占有比重较小。故有专家建议以黄虻属双斑黄虻Atylotus bivittateinus Takahasi，并增加虻属市场通行品种，如土灰虻（原野虻）Tabanus amaenus Walker，杭州虻T.hongchouensis Liu，广西虻T.kwangsinesis Wang et Liu，布虻（佛光虻）T.budda Portschinsky及汉斯虻T.haysi Philip为中药虻虫的原动物。此研究所揭示的虻虫用料混杂情况，与之前的报道相符[17-18]。

中药基原的准确鉴定对于保证中药的安全性、有效性及质量稳定性均具重要意义[19]。进一步的，对于已上市中成药所含成分的鉴定与遗传多样性的描述，既是生产质量评价与合理临床运用的潜在要求[20-21]，也是中药研究科学性与真实性的前提条件。随着高通量测序成本的快速下降，通过多个中成药样本的并行测序，可以期待宏条形码技术在中药领域发挥更大的作用。

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The origin identification of Chinese traditional medicine Dahuang Zhechong pill based on metabarcoding method

TIAN Xiao-xuan,LIU Jie,DOU Yong-jie,ZHAO Ya-nan,LV Chao-geng,ZHANG Chun-hui,ZHU Yan
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the ability of metabarcoding technology as one kind of identification tool for the origin of Chinese traditional patent medicine.[Methods]The DNA of TCM Dahuang Zhechong pill was extracted by paramagnetic particle method,and the 16S,trnL and Mini-barcode fragments were amplified by real-time PCR.The products of PCR were cloned and sequenced.After BLASTn alignment,the sequences were parsed into taxonomic term by MEGAN.The sequences representing TCM Mengchong were analysed by MEGA.[Results]The TCM Qicao,Mengchong,licorice and Peach Seed&Bitter Apricot Seed were identified from 23 sequences.Three groups of individuals with significant genetic differences were identified from 6 sequences that representing TCM Mengchong.[Conclusion]Metabarcoding technology could be used for component identification of Chinese traditional patent medicine and should be an useful tool for quality evaluation of Chinese traditional patent medicine.

Chinese traditional patent medicine;Dahuang Zhechong pill;metabarcoding;taxonomy assignment;genetic analysis

R284.1

：A

：1672-1519（2014）04-0234-04

2014-01-20）

（本文编辑：高 杉，马 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.14

国家自然科学基金项目（81202874），高等教育博士学科点专项科研基金（20121210120006），国家科技支撑计划项目（2012BAI29B01）。

田晓轩（1982-），男，博士，助理研究员，主要从事动物类中药资源与鉴定研究。

朱 彦，Email:yanzhu.harvard@gmail.com