UPLC法同时测定不同产地大黄中游离蒽醌的含量*

刘炳旺，徐文贵，王 健

（天津医科大学肿瘤医院分子影像及核医学诊疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060）

UPLC法同时测定不同产地大黄中游离蒽醌的含量*

刘炳旺，徐文贵，王 健

（天津医科大学肿瘤医院分子影像及核医学诊疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060）

[目的]建立超高效液相色谱法同时测定13批不同产地大黄中大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素等5种游离蒽醌的含量。[方法]采用Waters BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速0.3 mL/min，柱温30℃，检测波长254 nm。[结果]大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素分别在1.61～80.30，4.98～249.20，3.27～163.30，9.65～482.50，1.67～83.30 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，平均回收率分别为99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。相对标准偏差（RSD）分别为1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。[结论]该方法简便可行，重复性良好，可用于大黄药材的质量控制。

大黄；含量测定；超高效液相色谱法

《中国药典》2010年版（一部）收载的大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L）、唐古特大黄（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（R.officinale Baill）的干燥根及根茎，具有泻下攻击，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效[1]，为治疗热结便秘之要药。大黄化学成分复杂，主要含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯苷类以及鞣质类化合物，现代药理研究表明大黄具有抗感染[2]、利胆[3]、止血[3]、抗肿瘤[4]、治疗慢性肾功能不全[5-7]等功效，在预防和治疗多器官功能不全综合征和多器官功能紊乱综合征方面亦有显著疗效[8]。

1 仪器和试药

安捷伦1290超高效液相色谱仪系统，包括：二元高压泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）等，AX205十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司），BP121S万分之一天平（德国塞多利斯公司），超纯水机:Mili-QⅡ型（美国Millipore公司），KQ-300B型超声波清洗器（江苏昆山分析仪器厂）。对照品大黄酸（110757-200206）、大黄酚（110796-201017）、大黄素（110756-200110）、大黄素甲醚（110758-200912）、芦荟大黄素（110795-200806）购于中国药品生物制品检定所。乙腈（Fisher）、甲酸（TEDIA）均为色谱醇，其他试剂为分析纯。大黄药材购于天津市中药饮片厂。

2 方法与结果

2.1 混合标准品储备液的制备 精密称取大黄酸对照品2.41 mg，芦荟大黄素对照品2.50 mg分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，摇匀，即得大黄酸和芦荟大黄素储备液。精密称取大黄酚对照品2.99 mg，大黄素1.96 mg，大黄素甲醚5.79 mg分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，摇匀，即得大黄酚、大黄素和大黄素甲醚的储备液。精密量取各储备液及甲醇1 mL等体积混合，摇匀即得含大黄酸80.3 μg/mL，大黄酚249.2 μg/mL，大黄素163.3 μg/mL，大黄素甲醚482.5 μg/mL，芦荟大黄素83.3 μg/mL的混合对照品储备液。

2.2 供试品溶液的制备 将大黄药材粉碎，过40目筛，精密称取约0.5 g药材置50 mL具塞三角瓶中，精密量取25 mL 100%甲醇，称质量，超声60 min，放冷后加甲醇补足质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即为供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱为WatersBEHC18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流动相：乙睛（A）：0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速：0.3 mL/min，柱温：30℃，检测波长：254 nm；进样量：1 μL。理论塔板数以大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素计算均不低于5 000，5个成分与相邻峰之间分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间。对照品及样品图谱见图1，2。

图1 混合对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solution

图2 样品S1的UPLC色谱图Fig.2 UPLC chromatogram of sample S1 solution

2.4 线性关系的考察 精密移取混合对照品储备液，采用逐级稀释方法，以甲醇配制一系列混合对照品溶液：大黄酸浓度为1.61，4.02，8.03，16.06, 40.15,80.3 μg/mL；大黄酚浓度为4.98，12.46，24.92, 49.83,124.6,249.2 μg/mL；大黄素浓度为3.27，8.17, 16.33,32.67，81.67，163.3 μg/mL；大黄素甲醚浓度为：9.65,24.13,48.25,96.50,241.30,482.50 μg/mL；芦荟大黄素浓度为1.67,4.17,8.33,16.67,41.67, 83.33 μg/mL。吸取上述系列溶液1 μL注入超高效液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件进行分析。分别以对照品浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素的标准曲线回归方程及线性范围（见表1），表明各化合物在相应的浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 取样品S1（产地：四川），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以峰面积计算，大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素的相对标准偏差（RSD）分别为0.81%、0.32%、0.62%、1.56%、0.54%。

表1 线性关系实验结果（n=6）Tab.1 The results of the linear relationship test（n=6）

2.6 稳定性实验 取样品S1，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，每2 h进样1次，以峰面积计算，大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素的RSD（n=7）分别为0.59%、1.34%、1.09%、2.33%、0.37%。结果表明：室温条件下供试品溶液中各化合物在12 h内稳定。

2.7 重复性实验 取样品S1，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，进行测定，结果表明大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素的含量平均值分别为 0.22%，0.50%，0.09%，0.92%，0.12%。RSD分别为0.63%，0.45%，0.55%，0.52%，1.32%。

2.8 加样回收率实验 取“2.7”项下重复性实验已测知含量的药材粉末0.25 g，置50 mL具塞三角瓶中，分别加入大黄酸对照品0.55 mg、大黄酚对照品1.25 mg、大黄素对照品0.23 mg、大黄素甲醚对照品2.3 mg、芦荟大黄素对照品0.30 mg，按“2.2”项下方法制备供试溶液，重复5次，结果上述5种化合物平均回收率分别99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。RSD分别为1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。

2.9 含量测定 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定13批不同产地大黄中大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素的峰面积，分别根据各自的标准曲线方程计算含量，每批药材平行操作2份。结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 《中国药典》2010版规定检测波长为254 nm，通过文献及实际操作过程发现254 nm各色谱峰分离较好，280 nm基线也较好，但响应值不如254 nm。

3.2 色谱条件的选择 实验中考察了甲醇-0.1%甲酸水系统、乙腈-0.1%甲酸水系统。结果表明乙腈-0.1%甲酸水系统色谱峰分离度较好且柱压较低，因而选择乙腈-0.1%甲酸水系统。实验中还对柱温进行了考察（25、30、35、40℃），结果表明30℃分离达基线且出峰时间较短。

表2 不同产地大黄含量测定结果Tab.2 The determination results of the different samples %

3.3 提取方法、提取溶剂及提取时间的考察 实验中比较了超声和回流提取差别，结果表明超声30min与回流30 min基本无差异，考虑到超声方便快捷的优点，最终选择超声提取法。实验中分别采用50%、75%和100%甲醇对大黄药材进行提取溶媒浓度考察，结果表明100%甲醇对于5种游离蒽醌的提取效率最高。实验中还考察了提取时间（30、45、60、120 min），结果表明60 min目标化合物峰面积明显优于30 min和45 min，但120 min与60 min差异不大，表明60 min基本提取完全。

本研究建立了大黄中5种游离蒽醌的UPLC含量测定方法，并应用此方法对不同产地的13个批次药材进行了评价。结果表明，该方法可行，分离度较高，可用于大黄药材的快速含量测定。

[1] 卫生部药典委员会.《中华人民共和国药典》（2010）[S].北京:化学工业出版社,2010:22.

[2] 瞿佐发.大黄的药理作用及临床应用[J].陕西中医,2002,23(6): 552-554.

[3] 郭望祥.大黄的药理研究概况[J].江汉大学学报(医学版),2002,30(2): 60-61.

[4] 丁 艳,黄志华.大黄素的抗肿瘤作用研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(5):1272-1274.

[5]林嫦娥,赵 强,黄文郑.大黄及其复方制剂治疗慢性肾功能衰竭的临床研究进展[J].天津中医药,2003,20(5):79-80.

[6] 姜 云.大黄、黄芩、黄连、黄柏在现代临床医学中的运用[J].天津中医药,2008,25（3）:215-216.

[7]韩家强,谭联声,王金萍.关于大黄及含大黄方剂治疗慢性肾功能不全的临床研究[J].天津中医药,2010,27（3）:194-196.

[8] 景浩然,柴丽娟,郭 虹,等.大黄酸对内毒素激活小胶质细胞的影响[J].天津中医药大学学报,2012,31（1）:34-35.

[9]王淑蓓,元恒杰,戚爱棣.HPLC法测定小儿消褪糖浆中大黄酚含量[J].天津中医药大学学报,2009,28（2）:89-91.

[10]许舜军,李鸿燕,曾元儿,等.反相高效液相色谱法测定大黄药材五种蒽醌类成分的含量[J].时珍国医国药,2006,17(7):1201-1202.

[11]王雪芹,赵祖兴,陈吉炎,等.武当山5种土大黄中3种蒽醌类成分的含量比较[J].医药导报,2010,29(9):1206-1208.

[12]杨月娥,胡文帅,庞 婕,等.道地产区大黄中5种蒽醌类化合物含量测定[J].安徽农业科学,2011,39(11):6378-6379,6429.

[13]王洪兰,陈 瀚,柴宝娟,等.大黄特征图谱研究及游离蒽醌含量测定[J].中国民族民间医药杂志,2010,19(18):30-31.

Simultaneous determination of free anthraquinones in Rhubarb from different habitats by UPLC

LIU Bing-wang，XU Wen-gui，Wang Jian
（Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of“Cancer Prevention and Therapy”，Tianjin 300060，China）

[Objective]To develop a UPLC method for simultaneous determination of five anthraquinones(Rhein，Chrysophanol，Emodin，Physcion and Aloe-emodin)in Radix et Rhizom a Rhei from different habitats.[Methods]The analysis was performed on Waters BEH C18column(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)with a gradient mobile phase of acetonitrile(A)-0.1%Formic acid solution(B)(0～3 min，19%→25% A，3～10 min，25%→100%A)at flow rate of 0.3 mL/min.The column was maintain at 30℃and the detection wavelength was set at 254 nm.[Results]The linear ranges were 1.61～80.30 μg/mL for Rhein，4.98～249.20 μg/mL for Chrysophanol，3.27～163.30 μg/mL for Emodin，9.65～482.50 μg/mL for Physcion and 1.67～83.30 μg/mL for Aloe-emodin.The average recoveries of the five compounds were 99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%and RSD were 1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%respectively.[Conclusion]The rapid and accurate UPLC method was established.This method can be used to assess the quality of Rhubarb.

Rhubarb；determination；UPLC

R284

：A

：1672-1519（2014）04-0238-03

2013-12-13）

（本文编辑：高 杉，马 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.15

国家自然科学基金资助项目（30872954），天津市卫生局科技基金资助项目（2012KZ064）。

刘炳旺（1981-），男，药师，主要从事正电子药物的生产及药物分析。

徐文贵，E-mail：wenguixy@tom.com。