金芪降糖片对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究*

郑 凝，魏世津

（天津市泰达医院血液净化科，天津 300457）

·实验研究·

金芪降糖片对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究*

郑 凝，魏世津

（天津市泰达医院血液净化科，天津 300457）

[目的]观察金芪降糖片对糖尿病大鼠肾组织晚期糖化终末产物受体（RAGE）、转化生长因子－β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。[方法]测定造模后20周糖尿病组（DM组）、糖尿病给药组（DD组）和对照组（N组）大鼠24 h尿微量白蛋白定量（UMA）、平均血糖（APG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、内生肌酐清除率（Ccr）、RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平及肾脏形态学改变，评价金芪降糖片的肾保护作用。[结果]与DM组相比，DD组平均血糖、TC差异无统计学意义，Ccr高于DM组，而UMA、TG、RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平降低，差异有统计学意义；光镜和电镜下，DD组肾组织损伤程度均轻于DM组。[结论]金芪降糖片可以减轻糖尿病慢性肾损伤的程度，其肾保护作用可能与其降脂及降低RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平有关。

金芪降糖片；糖尿病肾病；RAGE；TGF-β1；VEGF；CTGF

金芪降糖片组方源于《备急千金方》中的“千金黄连丸”，由黄连、黄芪、金银花组方，主要用于降糖治疗。笔者发现部分Ⅲ期糖尿病肾病患者应用金芪降糖片后24 h尿微量白蛋白（UMA）可以降低，并且金芪降糖片可能具有拮抗晚期糖化终末产物（AGEs）的作用[1]，故推测其可能具有肾脏保护作用。本实验观察金芪降糖片对链脲菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并探讨相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及模型的建立、分组 12周龄的成年SD雄性大鼠，体质量为（200±20）g，为同批繁殖的封闭群，购于天津药物研究院。适应性喂养2周后随机留取10只作为正常对照组（N组）。其余禁食12 h后称体质量、测血糖，以60 mg/kg STZ（溶于枸橼酸缓冲液）尾静脉注射，对照组尾静脉注射枸橼酸缓冲液，于给药后第3天和第14天测定空腹血糖，两次血糖均≥16.7 mmol/L者为造模成功，共46只。将造模成功的大鼠以血糖为标准按分层随机分组方法分为糖尿病对照组 [DM组，23只，血糖：（23.31± 4.13）mmol/L]和糖尿病给药组[DD组，23只，血糖：（23.47±4.12）mmol/L]。DD组按4.2g/（kg·d）给与金芪降糖片生粉（由中新药业隆顺榕制药公司提供）灌胃，DM组和N组给与等量生理盐水灌胃，每周测体质量1次，根据体质量调整给药量，不给与其他药物，每两周经鼠尾静脉取血测血糖1次，共喂养20周，计算平均血糖值（APG）。

1.2 主要试剂与仪器 STZ（美国Sigma），β-actin（β-肌动蛋白）、小鼠单克隆RAGE抗体（美国B&D），兔抗鼠多克隆TGF－β1抗体、兔抗鼠多克隆VEGF抗体、羊抗鼠多克隆CTGF抗体（美国Santa Cruz），辣根酶标记羊抗兔及兔抗羊二抗、电化学发光显色剂（美国Pierce）；荷兰MICROLAB300自动生化分析仪，JAMMA-C12DPCγ计数器，荧光分光光度计（日本BROMM），乐康全血糖仪（香港罗氏）；Pharmacia垂直板蛋白电泳仪；Digital ScienceTM 1D Image Analysis Software图像分析系统（美国Kodak）。

1.3 标本采集 在实验的第20周末，各组大鼠入代谢笼，留取24 h尿，记录尿量，检测尿肌酐、24 h微量白蛋白（UMA）。股动脉放血处死大鼠，留取血标本，测血清肌酐、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC），计算内生肌酐清除率（Ccr）。迅速摘取两侧肾脏，右肾经生理盐水和0.1%二乙基焦磷酰胺（DEPC）水冲洗后，液氮中保存，用于Western Blotting检测；左肾去包膜纵向切开，左肾上极取4～5块1 mm3组织置于2.5%戊二醛固定液中固定，用于透射电镜检查；其余左肾组织于4%多聚甲醛中固定24 h,常规石蜡包埋，切片（4 μm）用于形态学检查。

1.4 Western Blotting检测RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF蛋白表达 用蛋白裂解液提取组织蛋白，5% SDS-PAGE浓缩胶+10%SDS-PAGE分离胶电泳，转移蛋白至硝酸纤维膜上，以5%脱脂奶封闭，分别加入RAGE单克隆抗体（1∶500，37℃孵育2 h），兔抗鼠多克隆TGF-β1抗体（1∶1 000，37℃孵育2 h），兔抗鼠多克隆VEGF抗体（1∶1 000，37℃孵育2 h）,羊抗鼠多克隆CTGF抗体（1∶1 000，37℃孵育2 h）。PBST洗膜，加入相应二抗（1∶5 000）孵育1 h，PBST洗膜，化学发光法显影，以β-actin作为内参，进行半定量分析。

1.6 统计方法 使用SPSS 18.5统计软件，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较时，若方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠生化指标 DD组和DM组大鼠体质量轻于N组，平均血糖高于N组，差异有统计学意义，DD组和DM组之间体质量和APG差异无统计学意义；DD组和N组24 h UMA低于DM组，差异有统计学意义；DM组Ccr较N组和DD组降低，差异有统计学意义；DD组TG水平高于N组但低于DM组，差异有统计学意义。DD组和DM组TC水平较DM组升高，差异有统计学意义。见表1。

2.2 金芪降糖片对糖尿病大鼠肾皮质 RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF表达的影响 见表2、图1。DM组RAGE、TGF-β1、VEGF和CTGF蛋白表达水平显著性高于N组（P＜0.05）和DD组（P＜0.05），而DD组与N组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠肾脏形态学改变 与N组和DD组相比，光镜下DM组肾小球体积轻度增大，毛细血管腔扩张，近曲和远曲小管管腔扩张，集合管周围间质细胞疏松、水肿（见图2）。电镜下DM组近系膜侧基膜增宽，以内皮下侧基质增加明显，且电子密度不均匀。足细胞数量增多，细胞体积增大，足细胞突起阶段性融合。DD组上述病理改变明显轻于DM组（见图3）。

表1 各组大鼠体质量、APG、UMA、GFR比较（±s）Tab.1 Comparison of the levels of body weight,APG, UMA,GFR in rats in each group（±s）

表1 各组大鼠体质量、APG、UMA、GFR比较（±s）Tab.1 Comparison of the levels of body weight,APG, UMA,GFR in rats in each group（±s）

注：与N组相比，*P＜0.05；与DM组比较，#P＜0.05。

APG（mmol/L）DD组 264.38±46.86*25.41±3.89* DM组 286.25±62.78*27.80±2.80* N组 434.50±40.58#5.42±0.21#项目 体质量（g）TC（mmol/L）2.67±0.36#2.87±0.56*#5.05±1.27* 2.31±0.23*4.35±0.92*5.33±1.09* 2.70±0.29#1.59±0.41#3.83±0.77#UMA（mg/d）6.95±2.65*#14.52±5.90* 4.36±1.03#Ccr（ml/min）TG（mmol/L）

表2 各组大鼠肾皮质TGF-β1、VEGF、CTGF水平比较（±s）Tab.2 Comparison of the levels of TGF-β1,VEGF and CTGF in cortex of kidney of rats（±s）

表2 各组大鼠肾皮质TGF-β1、VEGF、CTGF水平比较（±s）Tab.2 Comparison of the levels of TGF-β1,VEGF and CTGF in cortex of kidney of rats（±s）

注：与N组相比，*P＜0.05；和DM组间比较，#P＜0.05。

组别 RAGE VEGF TGF-β1 CTGF DD组 8.26±4.47#0.42±0.18#2.70±1.60#2.37±1.38#DM组 17.44±7.91* 1.35±0.88* 4.91±1.50* 4.34±2.44* N组 7.00±3.54#0.40±0.21#2.57±1.20#2.31±1.44#

图1 Western blotting测定大鼠肾皮质RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGFFig.1 Detection of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in rats by Western blotting

图2 大鼠光镜下肾组织形态Fig.2 Histology nephropathy under light microscope in rats

图3 大鼠电镜下肾组织形态Fig.3 Ultrasructural pathology in nephropathy of rats

3 讨论

DD组大鼠24 h UMA低于DM组，Ccr高于DM组，形态学的病理变化也轻于DM组，提示金芪降糖片具有肾保护作用。而本次实验动物造模为1型DM，DD组和DM组平均血糖差异无统计学意义，表明金芪降糖片的肾保护作用是独立于血糖因素之外的。

目前学术界在DN领域研究的热点之一是转化生长因子－β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)与DN发病的关系。近年的研究又发现TGF-β的下游因子CTGF有很强的致纤维化作用，与多种肾病的纤维化改变密切相关。VEGF是1989年被证实存在于体内的一类糖蛋白，与血管内皮细胞上的受体结合，可促使内皮细胞产生有丝分裂，诱导内皮细胞增殖和迁徒，诱导新血管生成，增加血管通透性，促进血浆蛋白渗出到血管间隙，诱发局部炎症反应[2]。TGF-β为调节细胞生长和分化的一组超家族分子，有5种同分异构体：TGF-β1－TGF-β5，以TGF-β1最为重要。TGF-β1主要由肾间质的成纤维细胞和肌纤维母细胞产生，肾小管和浸润于肾间质的单核细胞也是TGF-β1的重要来源。目前已经证实，TGF-β1是一种强效的致纤维因子，被认为是肾纤维化病变中最重要的作用因子。糖尿病肾病的主要病理改变是炎症和纤维化，TGF-β1在糖尿病肾病的发生和发展中扮演着重要角色，被有的学者称为糖尿病肾病病变中“最坏的坏蛋”[3-4]。1991年Bradham等首次发现了CTGF。在成人组织中CTGF mRNA在诸多器官有表达，特别在肾脏有较高的表达。目前已知CTGF是TGF-β1的下游因子,其生物学效应有：加速DNA合成、促进细胞增殖，促进新生血管形成，介导细胞黏附，刺激细胞迁移等。在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生、发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等，因此CTGF在组织器官纤维化的发生、发展中起着重要作用[5]。

本次实验中，VEGF、TGF-β1、CTGF结果相近，DM组这3种因子水平在20周显著性升高，提示这些肾损伤因子在DN的发病机制中也占重要地位。3者很可能存在着协同作用，CTGF是TGF-β1的下游因子，而VEGF和TGF-β1也有密切的联系。有学者发现，在尿蛋白水平正常的1型糖尿病患者体内就存在VEGF、TGF-β1、CTGF表达上调的现象，伴有巨噬细胞趋化蛋白1（MCP-1）、γ干扰素（IFN-γ）等炎性因子表达增多[6]。有学者报道高糖环境下足细胞表达VEGF增多，随后可诱发单核吞噬细胞(MPs)的募集和活化，以及TGF-β1的生成增多，导致足细胞凋亡，加快肾小球纤维化[7]。已有多个实验发现，在糖尿病患者和糖尿病动物模型的肾小球膜和肾小管袢发现TGF-β1及CTGF的mRNA和蛋白水平明显增高[8]，CTGF促进TGF-β1与其受体的结合[8]，而TGF-β1则通过活化MAPK通路促进CTGF表达[9]。用抗纤维化药佛非尼酮（Fluorofenidone）抑制ERK1/2,P38和JNK磷酸化，从而阻断MAPK通路，可抑制CTGF表达[9]。采用抗－TGF-β1抗体短期治疗可以抑制糖尿病小鼠肾小球系膜细胞外基质分子的表达和肾小球肥大的进展,长期治疗则可以抑制肾小球系膜基质扩展和肾功能的减退,但对蛋白尿无影响[10]。可见,VEGF、TGF-β1和CTGF的活化与DN的发生和发展有密切关系。

DD组VEGF、TGF-β1、CTGF的表达都可被金芪降糖片抑制，提示三者在发挥生物学效应时可能存在共同的节点或交叉步骤，而这个节点又可被金芪降糖片抑制，据此推论这个节点很可能是RAGE。AGEs是糖、蛋白质、脂质间非酶促反应的终末产物，可以修饰蛋白，引起脂蛋白积累和氧化。其受体RAGE是免疫球蛋白超家族的一员,可作为跨细胞膜信息传递的通道，AGEs与RAGE结合可诱发氧化应激，活化补体，激活p21ras、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）、NF-кB等细胞信号传导途径的关键节点，引发炎性反应,从而刺激肾系膜细胞增殖，增加肾小球毛细血管内皮细胞通透性，促进凝血物质活化，从而引起一系列病理生理学变化，导致肾组织损伤和纤维化[11]。有报道AGEs-胎牛血清蛋白活化RAGE，通过MAPK、NF-κB等途径导致近曲小管间质表达VEGF、TGF-β1、CTGF增多[12]。Thoralf M等人用胰岛素抵抗的糖尿病鼠和RAGE缺乏的纯合子鼠为实验对象，在小鼠13周活化RAGE后，足细胞表达高水平的VEGF和VCAM-1，引起MPs的募集和活化，出现明显的肾小球系膜基质扩张和肾小球基底膜增厚，RAGE拮抗剂可以抑制这种情况，拮抗剂干预组小鼠的蛋白尿和肾小球硬化的程度明显轻于未治疗组，肾功能明显改善。RAGE缺乏的纯合子鼠则未出现明显的肾小球系膜基质扩张和肾小球基底膜增厚。结合这些情况，Thoralf M等人提出：RAGE的活化促进了VEGF的表达和炎症细胞在肾小球的募集和活化，从而促进了肾小球系膜细胞的活化和TGF-β表达，进一步促进了CTGF的表达,导致了蛋白尿和肾小球硬化[13]。本组实验的结果为上述说法提供了佐证，DD组RAGE受到抑制后VEGF、TGF-β1、CTGF的表达也明显降低，24 h UMA降低，Ccr升高。

金芪降糖片对RAGE抑制的机制尚不清楚，其所含的黄芪、黄连等成分，也是中医在糖尿病肾病治疗中最常用的药物[14-15]笔者推测可能与其抗氧化和降脂作用有关。蛋白质不仅可被糖类修饰，也可被脂类修饰，RAGE的配体AGEs有相当部分是来源于脂肪酸的，故高甘油三酯血症与AGEs的蓄积和RAGE的活化密切相关。而氧化应激也可以促进RAGE表达及活化，RAGE活化后又可以引起局部组织活性氧（ROS）大量生成，加重氧化应激，促进炎性因子释放[16]。申竹芳报道，金芪降糖片能使花生油灌胃的高血糖小鼠血甘油三酯水平下降75.6%，使高糖高脂喂养大鼠的血甘油三酯水平下降39%，并使患脂肪肝动物的甘油三酯含量降低40%[17]。本次实验中，笔者也发现DD组TG水平低于DM组。另外，糖尿病动物机体抗氧化能力下降，血或尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性升高，而金芪能使糖尿病小鼠肝脏丙二醛（MDA）含量降低18.5%，血NAG酶活性下降48.8%[17]。还有报道，金芪降糖片可以改善胰岛素抵抗，降低血浆纤溶酶原抑制物（PAI-1）水平，升高组织纤溶酶原激活物（t-PA）活性[18]。抑制了氧化应激，降低了甘油三脂水平，金芪降糖片就可以有效地拮抗AGEs物质的产生和RAGE的持续高表达，并拮抗VEGF、TGF-β1、CTGF的表达，改善纤溶活性，减轻肾组织损伤。

综上所述，金芪降糖片具有独立于血糖因素以外的肾保护作用，其机制可能与其降脂、抗氧化作用抑制RAGE表达，降低肾组织VEGF、TGF-β1、CTGF水平有关，从而为糖尿病肾病的防治提供了新的思路。

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Experimental study of protective effect of Jinqi sugar-lowering tablet on kidney in rats with diabetes

ZHENG Ning,WEI Shi-jin
（Department of Blood Purification Center,TianJin TEDA Hospital,Tianjin 300457,China）

[Objective]To observe the effect of Jinqi sugar-lowering tablet on the expression of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in kidney of rats with diabetes.[Methods]The level of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in kidney in group of rats with diabetes（group DM）,group in diabetes with Jinqi tablet（group DD）and control group（group N）was determined at 20 weeks after inducing of diabetes.Their average plasma glucose （APG），triglyceride （TG），total cholesterol（TC），endogenous creatinine clearance （Ccr）and urine microalbumin were recorded.[Results]Compared to the group DM,the level of UMA,TG,RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in group DD was lower（P＜0.05）,but the Ccr was higher.The level of APG and TC between group DD and group DM was not different.Renal pathological changes in group DD was better than that in DM group.[Conclusion]Taking Jinqi Sugar-lowering tablet may decrease the renal damage of diabetes.The renal protection of Jinqi Sugar-lowering tablet is related with controlling blood sugar and it may be related with the inhibition of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF.

Jinqi sugar-lowering tablet;diabetic nephropathy;RAGE;TGF-β1;VEGF;CTGF

R587.1

：A

：1672-1519（2014）04-0226-05

2013-12-10）

（本文编辑：马 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.12

天津市中医药管理局中西医结合科研课题（11112），天津市滨海新区卫生局医药卫生科技项目（2011BHKY015）。

郑 凝（1972-），男，博士，副主任医师，主要从事糖尿病肾病，肾功能衰竭，血液净化的研究工作。