猪瘟病毒分子生物学及猪瘟防控概述

廖生钱 福建省南靖县山城镇畜牧兽医站 363600

猪瘟病毒分子生物学及猪瘟防控概述

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猪瘟又称“烂肠瘟”，是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种传染病。它具有高度传染性和致死性，我国1984年就将猪瘟列为一类动物疫病[1]。到21世纪的今天，猪瘟仍是造成世界上大多数的养猪大国重要经济损失的疾病之一。

早在1903年，就有学者确定了猪瘟病毒的病原体是一种滤过性病毒。猪瘟的高免血清最早被成功研制是在1908年的匈牙利，这也从侧面表明猪瘟当时已在欧洲相当流行。日本1909年报道发生了猪瘟，并开始研究该病。1925年，中国东南大学农科系也开始研制免疫血清用于防治猪瘟[2]。

1 病 原

1.1 形态与结构 到目前为止，仍只发现猪瘟病毒只有一个血清型，但毒力的强弱却是有分别的。猪瘟病毒粒子直径34～50 nm，略呈圆形，具有脂蛋白囊膜。在电镜下观察，可以发现病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。猪瘟病毒的等电点是4.8，在蔗糖密度梯度中的浮密度是每立方厘米1.15～1.16 g。

1.2 病原的基因结构和功能 猪瘟病毒的基因组长大约12.3 kb，由中间一个大的开放阅读框（ORF）和两端非编码区 5'-UTR（untranslated re-gion）及3'-UTR构成。ORF编码一个多聚蛋白，该多聚蛋白由3 898个氨基酸残基组成，并在翻译后或翻译过程中，被病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白水解酶加工切割成 12种蛋白质：Npro（p23）、C（p14）、Ems（gp44/48或 E0）、E1（gp33）、E2（gp55）、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。在非编码区结构中，3'-UTR长222～243 bp，具有较高的属内保守性。5'端为一可变区域，3'端为无poly-A的尾巴，研究表明猪瘟病毒复制的起始位点就是位于3'端中的一段十分保守的富含ATTT的核苷酸序列中[3]。在该编码区通过与复制相关的RdRp酶和NS5B及相应辅助因子的作用下，以病毒RNA为模板，从3'-UTR起始部位处合成负链RNA，形成双链RNA中间体，紧接着以负链RNA为模板在相应病毒RNA的5'-UTR位置起始处以几何递增的方式合成病毒基因组RNA。5'-UTR可以构成比较复杂的二级结构，它的5'端缺乏甲基鸟苷帽子结构，长360～374 bp，是毒株间最保守的部分。在猪瘟病毒复制过程中，5'-UTR作为基因翻译的重要调控位点。另据报道，5'-UTR的5'-末端保守片段GTATACGAGGTTA还可能影响病毒的复制，在病毒增殖过程中起着重要的作用[3]。

1.3 蛋白质组成 猪瘟病毒的ORF编码含有3 898个氨基酸残基的多聚前体蛋白，这个多聚前体蛋白在宿主细胞蛋白酶的作用或病毒的作用下能够裂解为12种病毒成熟蛋白，其中8种为非结构蛋白，4种为结构蛋白。八个非结构蛋白分别为Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，4个结构蛋白为衣壳蛋白c和3种囊膜糖蛋白。 对3种囊膜糖蛋白的命名存在一定的争议，但主要有以下两种命名办法：一是命名为E0、E1、E2；二是命名为E2、E3、El。有研究人员认为前一种命名方式既能够与同一病毒科不同属的类丙型肝炎病毒属丙型肝炎病毒E1和E2蛋白相对应，又能体现出它们在基因组的顺序。许多文献表明，E0、E1、E2这三种病毒粒子是通过二硫键的作用以二聚体结构的形式存在于病毒粒子和感染的细胞中。研究发现，不同的糖蛋白结构在病毒复制中的作用也不同。

1.4 复制 猪瘟病毒在进入宿主体内后，通过以下两种方式进入宿主细胞内：一种通过囊膜糖蛋白E0和E2的作用下细胞膜融合；二是受体介导的内吞作用进入宿主细胞。猪瘟病毒在实验室中体外培养感染猪瘟病毒的细胞时，猪瘟病毒一般不引起培养细胞的病理变化。但在培养猪瘟病毒感染的猪肾细胞进行传代时，却能够导致囊膜糖蛋白E0的C端的Ser476突变为Arg残基。在猪瘟病毒进入宿主细胞后，猪瘟病毒的RNA是怎么样从核衣壳中释放的目前还不太明确。

猪瘟病毒为有囊膜的ssRNA病毒，其基因组是单股正链的。猪瘟病毒的复制和普通正链RNA病毒是一样的，就是猪瘟病毒在进入宿主细胞后，首先释放核酸作为RNA，然后合成酶和蛋白，最后在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，从基因组的3'到 5'方向复制合成负链RNA，与正链RNA形成复制中间体，然后复制中间体产生大量子代正链RNA，参与后续的蛋白质合成和病毒粒子装配过程。

调控猪瘟病毒基因组复制最关键的序列在于5'-UTR和3'-UTR，猪瘟病毒的复制主要包括以下两步：首先以正链RNA为模板合成负链RNA，然后以新合成的负链RNA为模板合成正链RNA。3'-UTR是猪瘟病毒基因组的第一调控位点，5'-UTR是猪瘟病毒以新合成的负链RNA为模板合成正链RNA时的重要调控位点，此外，5'-UTR还是猪瘟病毒基因翻译的主要调控位点。5'-UTR和3'-UTR中各存在一段17个碱基的区域，除了四个碱基错配外，其余彼此完全互补配对，这两个区域可能参与基因组的环化。依赖RNA的RNA聚合酶与正链RNA的3'-UTR的结合位点结合后，不需要引物的作用，以正链RNA为模板合成负链RNA。在依赖RNA的RNA聚合酶接触到位于5'-UTR内的复制起始识别单位的同时，就为合成第2条链做构象上的准备。依赖RNA的RNA聚合酶在到达5'终端时，由于发夹结构的作用，继续延长正在合成的RNA链。然后以负链RNA为模板通过copy-back的机制合成正链RNA，连接处的单链部分后来被水解。在BVDV的NS5B蛋白试验中证明了核苷酸转移酶活性，同时，试验中复制产物的双价RNA远远多于模板的双价RNA，也为证明copy-back机制的存在提供依据[4]。

1.5 致病机理 猪瘟病毒可以感染猪的许多器官，如脑、肾、舌、扁桃体、淋巴结等器官和腺体均能够检测到猪瘟病毒。

猪瘟病毒感染猪只后能够引起猪只产生免疫抑制，能够引起白细胞的减少特别是淋巴细胞的减少。这是由于猪瘟病毒对猪淋巴组织、血液、回肠等组织具有亲嗜性，在易感猪只感染猪瘟病毒时，猪瘟病毒首先进入猪的扁桃体、扁桃体外周淋巴结的上皮细胞和B滤泡，并在其内复制。急性猪瘟一般导致死亡的原因之一就是猪只感染猪瘟病毒后自身的免疫系统被破坏。

人工给猪只接种猪瘟强毒后发现，猪瘟病毒能够引起αβ-TCR+T细胞、γδ-TCR+T细胞的缺失。此外，猪瘟病毒能够导致宿主T淋巴细胞的增殖能力明显降低和B细胞的急剧减少。有研究表明，宿主感染猪瘟病毒后自身淋巴细胞的减少激活了细胞程序性死亡[5]。

2 猪瘟的诊断与防控

目前，猪瘟的诊断主要有临床综合诊断和实验室诊断。临床诊断主要通过猪瘟的临床症状、解剖后的病理变化以及流行病学调查等几方面进行综合考虑后进行断定。由于猪病越来越复杂，猪病的发生往往不是单一的而是多种疾病并发。所以，临床诊断存在一定的困难，要确诊一般依靠实验室诊断。

2.1 实验室诊断 目前，我国进行猪瘟的实验室确诊方法主要有以下几种。

2.1 .1 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA发展到今天，产生了许多种方法，如间接法、双抗体夹心法。需要指出的是，我国普遍用兔化弱毒苗进行强制免疫，猪血清中几乎都有猪瘟抗体，这给猪瘟抗体的检测带来一定的困难。

2.1 .2 免疫荧光（IFA） IFA有直接和间接两种。用免疫荧光实验诊断猪瘟最大的优点就是能够检测到带有猪瘟强毒的隐性猪，这对猪场进行猪瘟的净化具有重要的意义。

2.1 .3 琼脂扩散试验 （AGPT） 琼脂扩散试验有单向和双向两类，它的特点是操作简单，易于判定可测抗原或抗体。但敏感度低。

2.1 .4 兔体交互免疫试验 兔体交互免疫试验专门用于检测猪瘟病毒，它能准确可靠检测出送检病料中是否存在猪瘟病毒或者兔化弱毒，而且该实验方法对技术、实验设备等都要求不高。

2.1 .5 病毒学诊断 主要检测在组织中或组织细胞培养中的病毒。将病毒分离培养后，进行免疫酶染或免疫荧光染色，镜检。

2.2 防治 目前尚无针对猪瘟的特效药物，主要采取以预防为主、治疗为辅的综合性防治措施。根据我国有关法律法规，发生猪瘟并确诊后应对疫点进行全部扑杀和无害化处理。但结合我国国情和养猪业特点，显然不可能达到消灭和控制猪瘟病毒的目的。在我国现阶段，主要采取加强科学的饲养管理、因地制宜结合自身情况制定个性化的免疫程序、建立免疫监测淘汰感染猪逐步净化猪群、尽量做到自繁自养实行“全进全出”的饲养模式、截断传染源、定期合理消毒及无害化处理等相结合的综合防控措施。

3 存在问题

3.1 现场诊断困难 近年来，由于猪病越来越复杂和许多类似猪瘟临床症状的出现，加上猪瘟病毒毒力发生变化使得猪瘟越来越不好被诊断。要确诊是否被猪瘟病毒感染越来越依赖于实验室诊断，但实验室诊断需要具备一定的条件和设备，具有一定的局限性，目前也还未有现场就可以操作进行确诊猪瘟的办法。

3.2 猪瘟疫苗本身无法消灭猪瘟 不可否认，现在广泛使用的三大品系猪瘟弱毒疫苗（中国的C2株、法国的Thiverval株和日本的CPE2株）对控制猪瘟发挥了巨大的作用[6]。疫苗的使用，只是对机体产生防护层，只能降低猪瘟病毒的循环力度和传播范围，猪瘟疫苗本身是无法消灭猪瘟病毒的。而且致弱疫苗本身也存在基因突变或与野毒发生重组而造成毒力逆强的机率，同时猪瘟野毒仍然存在并以低水平在传播。

亚单位疫苗应用的先决条件是需要一个高效的表达系统。因为只有足够量抗原存在时才能诱导出保护性的免疫应答反应。但是现在能够高表达的亚单位疫苗很少[7]。

3.3 传统的饲养方式不利消灭猪瘟 我国养猪业的特点是规模化低、散养户多。散养户的猪只感染猪瘟后，往往没有进行科学的处理，导致成为持续的传染源。而且这些散养户在饲养的同时往往也配合泔水饲喂，而泔水往往携带猪瘟病毒。

3.4 免疫监测和早期预警困难 免疫后不管不问是消灭猪瘟病毒的主要障碍之一，我国还未有科学的免疫监测方法，使得疫苗注射和免疫监测严重脱钩。目前，也尚未发现对猪瘟进行早期预警行之有效的方法，我国也未有相关机构或个人对猪瘟早期预警工作进行深入系统的研究。

[1]国际兽疫局.哺乳动物,禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册 [M].3版.农业部畜牧兽医局,译.1996: 128-135.

[2]吕宗吉,涂长春,余兴龙.猪瘟流行特征的新变化[J].黑龙江畜牧兽医,2001（8）:39.

[3]袁东波,汤德元,曾智勇,等.猪瘟病毒的分子结构及其新型疫苗研究[J].世界农业,2007,345（1）:59-60.

[4]Flores E F,Kreutz L C,Donis R O.Swine and ruminant pestiviruses require the same cellular factor to enter bovine cell2s[J].J Gen Virol,1996,77（Pt6）:1295-1303.

[5]Zhong W,Gutshall L L,Del Vecchio A M.Identification and characterization of an RNA dependent RNA polymerase activity within the nonstructural protein 5B region of bovine viral diarrhea virus[J].J Virol,1998,72:9365-9369.

[6]李学伍,张改平,郭启祥,等.猪瘟病毒生物学特性研究概述[J].河南农业科学,2007(10):14.

[7]王镇,丁明孝.猪瘟病毒致病机制及防治的研究进展[J].畜牧兽医学报，1998,29（5）:449-454.

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1003-4331（2014）03-0027-03