分子诊断技术在心血管疾病诊疗中的应用

黄山

·综述·

分子诊断技术在心血管疾病诊疗中的应用

黄山★

心血管疾病已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。分子诊断技术已取得了长足的发展，可应用于心血管疾病诊的筛查，实现治疗模式向预测、预防及个体化模式的转变。在心血管疾病诊断方面，可针对不同的疾病需求采用不同的分子诊断策略对相关疾病进行诊断，主要包括免疫法检测转录因子、染色体检测、聚合酶链反应法检测外显因子、基因单核苷酸多态性（SNP）检测、基因突变检测、致病基因DNA测序、DNA甲基化检测、miRNA检测等技术。在治疗及疗效监测方面，可应用分子诊断技术进行相关的新药研发、个性化药物治疗、治疗方案选择等。同时，还可以应用于疾病的预后评价。

分子诊断技术；心血管疾病；应用

近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。分子诊断已经成为实验诊断学的一个重要组成部分，其内容从初期的单一诊断遗传性疾病发展到一个全新阶段，广泛应用于感染性疾病、肿瘤及遗传性疾病诊断等多个医学领域。相对于感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤性疾病的分子诊断，分子诊断技术在心血管疾病的应用较为滞后，但也取得了不菲的成绩，现综述如下。

1 分子诊断技术的发展

分子诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。分子诊断以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。分子诊断的常用技术方法有：①核酸分子杂交技术，包括Southern印迹（southern blot杂交），Northern印迹（Northern blot杂交），斑点杂交（dot blot），原位杂交（insituhybridization）等；②PCR及相关应用技术，包括等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法、单链构象多态（SSCP）分析、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析、微卫星DNA分析技术等；③基因测序，是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质；④基因组学及分析技术，包括基因芯片、DNA微阵列（DNAmicroarray）技术等，利用核酸分子杂交原理，可用于大规模筛选和基因表达研究；⑤蛋白质组学及分析技术，作为功能基因组研究的重要支柱，研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律；⑥荧光原位杂交染色体分析技术（FISH），这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断；⑦波谱核型分析技术（Spectral karyotyping，SKY），主要用于肿瘤细胞的遗传学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面；⑧分子生物学相关技术的发展及作用，其中应用较多的有：一是毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE），现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、DNA序列分析等；二是液质联用质谱技术（LC／MS／MS），可在短时间内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病，在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛；三是变性高效液相色谱技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。

2 分子诊断技术在心血管疾病诊疗中的应用

2．1在筛查心血管疾病中的应用

基因筛查并非金标准，发现突变并不能完全预测、预后或确诊，因为有些致病基因携带者可能终生不发病，尤其是错义突变，需要进一步进行功能研究。但是基因筛查相对于临床诊断有很好的时效性，可以在发病前或在出现严重临床事件前及时采取相应的预防措施，降低猝死率。每一种检查都有一定的特异度和灵敏度，不能将各种疾病不完全外显造成假阳性而完全否定基因诊断的前景，存在致病基因突变有进一步发展致病的易感性，因此对于这部分病人建议进行跟踪随访。尽管目前研究还不能明确肯定特定基因突变对患者临床及预后的价值，但基因筛查对心血管患者的诊断和临床治疗仍具有不可估量的意义。

应用分子诊断技术进行疾病筛查，可以实现目前的诊断——治疗模式，转向预测——预防及个体化模式。应用分子诊断技术，可对部分心血管疾病进行筛查。青少年猝死的常见原因为肥厚型心肌病。深入了解肥厚型心肌病的遗传基础对理解这种最常见的心血管遗传疾病及给予最适合的处理具有重要意义。肥厚型心肌病发病涉及的基因有很多种，每种基因的突变部位又分布在不同的外显子及内含子上，因此，对肥厚型心肌病进行人群筛选，必须寻找一种经济方便的方法。应用分子诊断技术进行基因筛查改变了传统的HCM诊断方法，患者可以不依赖心室肥厚，而在发病以前就可以得到诊断（临床前诊断）［1］。2010年Voelkerding等人报道：应用新一代测序技术Next generation sequencing（NGS）为肥厚性心肌病的筛查及诊断提供了新方法。学者们用长片段PCR技术扩增HCM中的基因片段，发现Myosin，heavy chain 6、7（MYH6、7）、Myosin，light chain 2、3（MYL2、3）等16个基因中共有455个突变点可以用来筛查HCM，提高了疾病筛查的敏感性［2］。

现在的研究也表明，致心律失常性右室心肌病（ARVC）是一种桥粒病，桥粒功能异常是致病的最后通路，非桥粒基因可能通过影响桥粒发挥作用，而非桥粒基因迄今为止发现的家系及突变数目有限，因此建议先筛查桥粒成分基因，可对ARVC进行筛查［3］。2013年Campuzano等人针对家族中有成员发生心脏性猝死的15个西班牙家族进行基因检测及全身体格检查后发现，DSP_p．Q986X的遗传变异对致心律失常性右室心肌病的发生具有预示意义［4］。对于原发性高血压，尽管没有一个研究能够明确的易感基因，但是，针对多个基因的多个单核苷酸多态性进行筛查分析，可以实现在分子生物水平预防和治疗原发性高血压［5］。

2．2在诊断心血管疾病中的应用

对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略，以求达到最佳的诊断效能。目前分子诊断技术对于心血管疾病的基因诊断，主要应用于以下几个方面：

2．2．1免疫法检测转录因子

免疫法检测转录因子是将预先制备好的与相应转录因子特异结合的双链DNA通过核酸粘附液包被于酶链板孔中，与待测样品充分反应后，进行相应转录因子的免疫反应及显色反应，从而达到检测核转录因子活性的目的。本项分子诊断技术中DNA的包被不需特殊的预活化试剂和特殊的表面，具有包被省时、检测过程简便、无需特殊的仪器设备、适合作高通量检测、无放射性污染、灵敏度高和定量准确等优点。

与心脏发育、生长相关的遗传因素可直接导致许多心脏疾病的形成。转录因子Nkx2．5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一，与心脏发育密切相关，Nkx2．5基因突变导致先天性心脏病的发生。2013年Huang通过免疫法和基因及基因功能分析发现，转录因子Nkx2．5基因上游增强子的两个杂合DNA变异序列对小部分室间隔缺损的先天性心脏病发挥作用，通过这样的遗传研究能为先心病的治疗提供策略［6］。

2．2．2聚合酶链反应法检测外显因子

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断等诸多方面。

GATA-4基因与先天性心脏病关系密切，在心脏的发育过程中发挥着重要作用，它的单个或多个基因的突变及异常表达均可能会导致心脏畸形的发生，如房间隔缺损、法洛四联症、室间隔缺损等［7］，应用PCR技术对血液标本中GATA-4基因3，4，5，6外显子4对引物进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶中电泳，可进行定性定量分析，即可对CHD进行诊断。另外，2013年最新研究发现，Wei等人通过PCR技术发现GATA-5基因中有两个杂合突变位点p．R187G和p．H207R，均可导致法洛四联症的发生，并为人法洛四联症的早期预防和等位基因治疗法提供策略［8］。

2．2．3基因单核苷酸多态性（SNP）检测

SNP是一种最常见的可遗传变异，可分为两种形式，一是基因编码区的SNP，称为cSNP；二是遍布于基因组的大量单碱基变异，已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。例如，致心律失常性右室心肌病（ARVC），可以对PKP-2、TGFB-3和DSP［9］等相关突变基因进行单核苷酸多态性检测，分析基因型的差异，以探讨其基因多态性与疾病的相关性。也可以将检测结果通过与人类基因组序列多态性数据库（dbSNP）进行序列比较，选择相应的多态性位点并在家系其他成员中进行序列测定和比较分析，可得出相应的结论。

2．2．4基因突变检测

根据心血管疾病相关的目标基因，提取病人基因组DNA，可应用基因扩增和单链构象多态分析（PCR-SSCP）等分析技术，与正常对照组比较，即可对突变基因进行检测。同时，还可将扩增产物上高效液相色谱技术（DHPLC）进行分析，与正常组比较，分析其差异性，只要存在差异便可认为有异常。PCR-SSCP是在不测序情况下检测核酸变异的敏感方法。SSCP突变检出敏感性35％～100％不等，当DNA片段长度在300 bp以内时，SSCP分析检测基因突变的准确性为90％～100％。采用SSCP分析与毛细管电泳方法相结合技术，结果可使基因突变的检出敏感性达100％，并具有高通量检测的优点。例如，对先天性长QT综合征（CLQTS），可对其中的LQT1-3（KCNQ1、KC-NH2、SCN5A）等相关突变基因进行检测，分析基因型的差异，即可对这种遗传学心肌病进行诊断［10］。

2．2．5致病基因DNA测序

DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析，使临床分子诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂，一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。各种基因序列可由Genbank上获得，根据基因序列设计特异性引物，进行基因扩增，扩增产物可以进行测序检测，通过与人类基因组序列数据库（Build 36．3）进行序列比较，也可将测序结果与正常序列进行比对，即可得出结果。目前大部分遗传性高血压的基因诊断多依赖于直接的DNA测序技术，通过对致病基因的序列分析，可发现导致基因功能异常的各种形式的突变。

2．2．6DNA甲基化检测

很多研究显示，基因表观遗传学的改变与动脉粥样硬化有着密切的关系［11］，例如诱导同型半胱氨酸含量升高，可以改变人血管平滑肌细胞DNA甲基化的改变，从而导致动脉粥样硬化的发生，异常的DNA甲基化使血管平滑肌细胞增殖，并从中膜迁移至内膜参与形成动脉粥样硬化斑块。除全基因组DNA甲基化的变化与冠心病相关，一些特异性的基因甲基化也影响动脉粥样硬化的进展，如雌激素受体基因、P53基因、细胞外超氧化物歧化酶基因等。通过对动脉粥样硬化相关DNA的甲基化水平进行检测，即可了解动脉粥样硬化的进程。常用的甲基化检测方法有：限制性内切酶法、亚硫酸氢盐处理法和DNA芯片技术等。同样的方法可以应用于原发性高血压的诊断。

2．2．7miRNA检测

miRNAs参与调控动脉粥样硬化相关因素，包括内皮细胞的生长、分化、死亡和凋亡，以及内皮祖细胞、炎症细胞、细胞因子、脂质的调节等，从而促进动脉粥样硬化的发生发展［12］。对相关的miRNAs进行检测，可对动脉粥样硬化的发生、发展及预后进行诊断，目前国内外miRNA检测方法主要有：miRNA芯片、高通量测序法（Illina／Solexa）、Northern blot法和荧光实时定量逆转录PCR（QRT-PCR）法等。最新研究发现，Li等人通过qRT-PCR的方法证实MicroRNA-663是调节血管平滑肌细胞表型的改变的开关，同时可以调节血管新生内膜的形成，从而影响动脉粥样硬化的发生发展［13］。

2．3在治疗心血管疾病中的应用

2．3．1新药研发应用

由于大部分心血管疾病与基因相关，而且往往与多基因相关，因而，利用DNA芯片可以寻找基因与疾病的相关性，从而研制出相应的药物和提出新的治疗方法。新药物的开发常需筛选上千种化合物，在寻找作用于蛋白质的药物时，如利用靶蛋白制成芯片来直接筛选与其作用的化合物，将极大地提高药物开发的效率，实现高通量和自动化。同时，蛋白质芯片有助于研究药物与其效应相关蛋白质之间的相互作用，也是寻找药物作用靶点的有力工具。

2．3．2个性化药物治疗

药物基因组学（pharmacogcnomics）是一门基于功能基因组学与分子药理学的科学，它从基因水平研究基因多态性与药物效应多样性之间的关系。应用药物基因组学可以指导个体化医疗（personalized medicine）方案的制定，提高用药的安全性和有效性，避免严重不良反应，减少药物治疗的风险和费用。同时，可以根据药物基因多态性检测结果选择适合的治疗药物，避免一些副作用的发生。还可以根据药物代谢酶的基因多态性设计合适的用药剂量。例如，先天性长QT综合征（CLQTS）是一种以编码离子通道基因突变为基础的遗传性疾病［14］，其治疗必须针对各个遗传背景的差异而选择针对性的个体化治疗。

2．3．3治疗方案选择

儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）是一种遗传性心肌病，基因检测对该病的诊治至关重要。症状发生前获得该病遗传学诊断可及时对此种高致命性疾病进行预防，对疑似患者的早期诊断和治疗非常重要，如果诊断RyR2突变，可进行性别危险分层，男性患者预后更差，因此对该组人群应进行有效监测和积极治疗。

2．4预后评价

随着肥厚性心肌病（HCM）致病基因的不断发现，进行了不少基因型与表型及预后关系的分析研究［15］，提出分子诊断可能会对患者的危险度分层有帮助，尤其是对猝死危险性，并且提出了“良性突变”和“恶性突变”的观点。有些基因突变的携带者症状出现晚或症状轻微，甚至可正常存活，如A-原肌凝蛋白及cTnI上的某些突变；而有些突变携带者症状出现早，病情严重，甚至发生猝死，报道较多的为cTnT和B-MHC上的某些基因突变。既往研究表明肌球蛋白结合蛋白C基因突变携带者预后较好，而B-MHC基因突变预后较差，cTnT基因突变携带者虽然心脏肥厚不明显，但猝死发生率高。常规对HCM患者进行基因突变位点筛查可以提供重要的诊断和预后信息。

总之，分子诊断技术在心血管疾病诊疗上的应用，可实现以下几个方面的转变。第一，可实现治疗模式的转变，从注重疾病诊治到对生命全过程的健康监测，重预防，治未病。第二，可实现学科研究重点的前移，从生命后期前移至生命前期，疾病发生之前以至个体发生之前，控制出生缺陷。第三，可推行个性化治疗。但是，我们也要清醒的认识到，分子诊断技术在心血管疾病的诊疗上还处于初级阶段，离临床的推广应用还有很长一段距离，也应成为医学科学工作者奋斗的目标。

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The application of molecular diagnostic techniques in the diagnosis and treatment of cardiovascular disease

HUANG Shan
（Guizhou Province Center for Clinical Laboratory，Guizhou，Guiyang 550002，China）

Cardiovascular disease has become one of the most serious disease endangering people′s life and health in our country．Molecular diagnostic techniques have made great progress，which can be applied to screening for cardiovascular disease diagnosis and achieved paradigm shift from treatment to prediction，prevention and individualized．In cardiovascular disease diagnosis，molecular diagnostic technology can be applied according to different molecular diagnostic strategy for the diagnosis of related diseases，mainly including transcription factor immunoassay，chromosome testing，polymerase chain reaction detection of exon factor，gene single nucleotide polymorphism（SNP）detection，gene mutations，causative gene DNA sequencing，DNA methylation detection，miRNA detection technology．In terms of treatment and monitoring of curative effect，molecular diagnostic technology can be applied in new drug research and development，the selection of personalized medicine therapy and treatment options，etc．Meanwhile，it also can be used in the disease prognosis appraisal．

Molecular diagnostic techniques；Cardiovascular disease；Application

贵州省临床检验中心，贵州，贵阳550002

★通讯作者：黄山，E-mail：huangshan263＠sina．com