肾安颗粒对肾性骨病模型大鼠骨组织骨保护素表达的影响

邹新蓉 王小琴 王长江 袁军 朱守志

（湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

肾安颗粒对肾性骨病模型大鼠骨组织骨保护素表达的影响

邹新蓉 王小琴 王长江 袁军 朱守志

（湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

目的：探讨肾性骨病（ROD）模型大鼠股骨组织骨保护素（OPG）表达与骨代谢的关系及中药方肾安颗粒干预骨代谢的作用机制。方法：应用5/6肾切除加高磷饮水建立大鼠ROD模型，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、骨化三醇组和肾安低、高剂量组，分别给予相应药物灌胃8周，给药前后检测大鼠血清BUN、Scr、Ca、P、ALP，化学发光法测iPTH，双能X射线测骨密度，Western blot、免疫组织化学法检测股骨OPG表达。结果：肾安低、高剂量组大鼠血BUN、Scr与骨化三醇组、模型组比较明显降低；肾安低、高剂量组血Ca、骨密度与模型组比较明显升高，血P、ALP、iPTH与模型组比较明显降低；各组大鼠骨组织OPG蛋白表达，模型组显著低于正常对照组和假手术组，骨化三醇组和肾安低、高剂量组明显高于模型组；肾安低、高剂量组免疫组织化学表达比模型组明显增强。结论：ROD模型大鼠OPG表达异常与骨代谢密切相关，肾安颗粒可能通过上调OPG表达改善ROD骨代谢。

肾性骨病 肾安颗粒 OPG 实验研究

肾性骨病（renal osteodystrophy，ROD）是由慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）引起的矿物质代谢紊乱和内分泌失调所导致的骨病[1]，是CKD患者最常见和难治的并发症，也是终末期肾脏病患者致残的重要原因之一。导致ROD的生理病理机制十分复杂，由于肾脏结构和功能的破坏导致肾脏羟化酶系活性降低，1,25（OH）2VitD3的生成相对或绝对不足，甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）的合成与释放失控，是ROD发病的核心环节。但肾脏、骨骼分泌的多种局部及循环激素和细胞因子，如骨形成蛋白-7、成纤维细胞生长因子、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）等也参与其中。OPG作为骨形成与骨吸收动态平衡调节的重要因子，在ROD中表达情况及与骨代谢的关系如何？本实验观察ROD模型大鼠钙磷代谢、骨密度、PTH与OPG表达的关系及肾安颗粒干预后的变化，以期探讨中药复方干预ROD的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物SPF级Wistar雄性大鼠，8周龄，体质量120～150g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号：00009457。

1.2 药物与试剂肾安颗粒（药物组成：淫羊藿、黄芪、大黄，剂量比2∶2∶1）由湖北省中医院制剂室制备，用蒸馏水配制成混悬液，质量浓度分别为2.25g/mL、4.5g/mL；骨化三醇（规格：0.25μg/片）由海尔药业提供，用蒸馏水配制成质量浓度为50μg/100mL的悬浊液；血iPTH免疫检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），山羊抗OPG抗体（美国Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗（pierce），小鼠抗大鼠β-actin（美国abcam公司），两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒配制DAB溶液（丹麦DAKO公司）。

2 实验方法

2.1 5 /6 肾切除建立ROD大鼠模型SPF级W istar大鼠适应性喂养1周，以3%戊巴比妥钠（3mg/100g）腹腔注射麻醉。打开腹腔，暴露左侧肾脏，剥离肾包膜，结扎左肾上下极并切除，观察无出血后关闭腹腔。术后第2天开始给予高磷饮水（0.5g/d NaH2PO4）。1周后再次打开腹腔夹住右侧肾动脉和右侧输尿管并结扎，切除右肾并关闭腹腔。

2.2 分组与给药48只大鼠随机分为正常对照组（8只）、假手术组（8只）、造模组（32只）。正常对照组不实施任何手术。假手术组仅打开腹腔然后关闭，不切除肾脏。造模组按上述方法行5/6肾切除术后1个月，随机分为模型组、骨化三醇组、肾安低剂量（2.25g/mL）组、肾安高剂量（4.5g/mL）组，每组8只。肾安颗粒用蒸馏水配制成混悬液，骨化三醇用蒸馏水配制成浓度为50%的悬浊液，药物配制后置4℃冰箱保存备用。术后1个月开始给予相应药物灌胃，大鼠灌胃容量为每日1mL/100g，正常对照组、假手术组和模型组给予等容量生理盐水灌胃，持续8周。灌胃第3周，模型组和骨化三醇组大鼠各死亡1只。

2.3 标本采集给药前后眼球取血，测定尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、血磷（P）、血钙（Ca）、血清碱性磷酸酶（ALP）、血清全段甲状旁腺激素（iPTH）。给药结束后处死大鼠取完整双侧股骨，剥离肌肉，一侧干燥后测定股骨头部的骨密度（BMD），另一侧置于4%多聚甲醛中用于Western blot和免疫组织化学标本的制备。

2.4 生化指标及iPTH测定TOSHIBA120全自动生化分析仪检测BUN、Scr、P、Ca、ALP，IMMULITE 1000型免疫分析仪化学发光法检测血iPTH。

2.5 骨密度测定美国双能X线骨密度床机GE DPX-NT测定股骨头部骨密度。

2.6 Western blot检测提取大鼠股骨组织总蛋白，用Braford法检测蛋白含量，PAGE凝胶电泳仪制胶，每孔上样体积为40μL，电泳1.5h后取胶，在转膜仪上转膜。转完后放入TrisNaCl中清洗10min，转入5%脱脂奶粉中封闭1h以上，用PBST洗涤3次，每次10min，孵山羊抗OPG一抗，4℃冰箱过夜，取出后PBST洗涤3次，每次10min，孵二抗室温1h，TBST洗涤3次，每次10min，DAB显色，凝胶分析系统行密度扫描。

2.7 免疫组织化学检查骨组织石蜡切片烘片脱蜡，用PBS冲洗3次，每次5min；以EDTA微波修复；自然冷却后PBS洗3次，切片放入3%过氧化氢溶液室温孵育10min，PBS洗3次，甩干后5%BSA（牛血清白蛋白）封闭20min；甩去BSA液，加一抗，4℃过夜；PBS冲洗3次甩干，每张切片加50～100μL A液室温下孵育45min；PBS洗3次甩干，每张切片加50～100μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制显色；显色完全后蒸馏水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察。设不加一抗的阴性对照，以有棕黄色颗粒着色者为阳性，对每个染色后的标本顺序选取20个骨视野（×200），利用图像分析系统（HIPAS-1000）进行测量，染色阳性部位的深浅及范围大小以平均吸光度表示。

3 实验结果

3.1 各组大鼠用药前后BUN、Scr、iPTH检测结果见表1。3.2各组大鼠用药前后血Ca、P、ALP检测结果见表2。

3.3 各组大鼠股骨BMD检测结果模型组大鼠BMD明显低于正常对照组和假手术组（P＜0.05）；骨化三醇组、肾安低剂量组、肾安高剂量组与模型组比较骨密度明显增高（P＜0.05）；骨化三醇组、肾安低剂量组、肾安高剂量组3组间骨密度比较无明显差异。见表3。

3.4 Western blot检测各组大鼠股骨OPG蛋白的表达模型组大鼠股骨OPG蛋白表达明显低于正常对照组和假手术组；骨化三醇组、肾安低剂量组、肾安高剂量组表达明显高于模型组，其中以肾安低剂量组OPG蛋白表达增强更为明显。见图1。

表1 各组大鼠用药前后BUN、Scr、iPTH测值（±s）

表1 各组大鼠用药前后BUN、Scr、iPTH测值（±s）

注：与正常对照组用药前比较，#P＜0.01；与本组用药前比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组用药后比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与骨化三醇组用药后比较，※P＜0.05。

组别动物数（只）正常对照组8假手术组8模型组7骨化三醇组7肾安低剂量组8肾安高剂量组8 BUN（mmol/L）用药前用药后用药前7.47±0.88 7.33±0.59 23.57±5.88 iPTH（pg/dL）用药前用药后9.28±2.05 9.74±2.36 7.86±0.80 7.09±0.83 24.14±3.29 33.71±5.91 10.82±2.94 9.28±2.05 17.04±3.77#20.2±4.57 73.57±23.07#100.14±26.71 13.08±6.65#14.04±4.50 15.90±2.62#15.75±4.33 65.83±10.74#73.50±19.68 12.12±3.92#9.62±1.51▲▲★★15.67±4.18#12.5±2.51▲★72.33±21.40#59.67±9.37▲★※12.36±2.19#8.72±1.21▲▲★★15.72±3.84#13.7±2.34▲★74.60±16.50#60.80±8.32▲★※11.95±3.47#9.30±0.73▲▲★★Scr（μmol/L）用药后33.86±5.40

表2 各组大鼠用药前后血Ca2+、P3+、、ALP测值（±s）

表2 各组大鼠用药前后血Ca2+、P3+、、ALP测值（±s）

注：与正常对照组用药前比较，#P＜0.05；与本组用药前比较，▲P＜0.05；与模型组用药后比较，★P＜0.05；与骨化三醇组用药后比较，※P＜0.05。

组别动物数（只）正常对照组8假手术组8模型组7骨化三醇组7肾安低剂量组8肾安高剂量组8 Ca2+（mmol/L）用药前用药后用药前2.99±0.15 2.93±0.05 2.11±0.30 ALP（IU/L）用药前用药后156.57±23.25 122.43±29.11 3.07±0.08 3.16±0.16 2.36±0.48 2.47±0.42 156.14±28.02 128.71±48.93 1.99±0.41#1.87±0.45 3.84±0.59#4.13±0.91 181.57±42.27 197.00±31.53 2.11±0.84#2.98±0.12▲★3.65±0.74#3.41±0.73 167.33±21.95 130.67±22.98▲★2.00±0.26#2.76±0.12▲★3.48±0.64#2.56±0.15▲★※172.00±38.29 135.17±23.37▲★2.06±0.05#2.88±0.08▲★3.70±0.65#2.74±0.26▲★※182.20±20.69 133.60±40.67▲★P3+（mmol/L）用药后1.82±0.25

表3 各组大鼠用药后BMD测值（±s）

表3 各组大鼠用药后BMD测值（±s）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05。

组别动物数（只）BMD（g/cm2）正常对照组8164.75±41.60假手术组8 168.36±13.45模型组7 120.15±12.02#骨化三醇组7 160.13±4.86★肾安低剂量组8 165.73±8.22★

图1 Western blot检测各组大鼠股骨OPG蛋白的表达

3.5 免疫组织化学检测各组大鼠股骨OPG表达结果免疫组织化学所见棕色为OPG阳性表达。模型组大鼠股骨OPG表达与正常对照组、假手术组比较明显减弱；骨化三醇组、肾安低剂量组、肾安高剂量组OPG表达与模型组比较明显增强，其中以肾安低剂量组更为明显。见图2。

4 讨论

OPG是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族新成员，是由基质细胞、成骨前体细胞、破骨前体细胞产生的一种跨膜结构域的分泌性蛋白[2]，作为假受体通过与RANK竞争结合RANKL阻断其作用，抑制破骨细胞的分化、成熟，诱导破骨细胞凋亡。OPGmRNA在人体的多种组织和细胞系广泛表达，在肺、心脏、肾、肝、胃肠、脑、脊髓、甲状腺和骨中表达最多，动物实验表明以肾脏含量最多[3]。体外实验证实，OPG抑制前体破骨细胞分化和成熟破骨细胞形成骨吸收陷窝，而1,25（OH）2D3能抑制OPG mRNA的表达及OPG蛋白的合成，促进破骨细胞前体分化成熟，使破骨细胞数量增加，促进骨吸收，维持骨代谢平衡；体内实验注射重组OPG可诱导破骨细胞凋亡[4]。

OPG在体内的表达受多种因素调控，如1,25（OH）2D3、PTH、TGF-α、TGF-β、NO、IL-1β、Ca2+、雌激素、肾上腺素等。多种细胞因子和激素通过上调或下调RANKL/OPG间接对骨代谢发挥作用。实验表明，PTH长时间持续刺激导致破骨细胞的活动加强，使骨吸收作用增加，从而骨量减少[5]。PTH作为ROD进程中的核心环节之一，刺激破骨细胞的分化作用，是通过成骨细胞的OPG/RANKL/RANK系统的PKA信号通路，提高RANKL表达和降低成骨细胞生成OPG来完成[6-7]。OPG在骨质疏松症、免疫性骨关节病、骨硬化症、骨肿瘤及心血管病等临床疾病中的研究较多，但其在CKD和ROD中的研究鲜少报道。

本研究中，各造模组大鼠给药前BUN、Scr较正常对照组明显升高，血钙降低，血磷上升，PTH水平亦升高，血清ALP上升，表明随大鼠肾功能下降，其钙磷代谢紊乱，甲状旁腺功能亢进，骨重塑与形成减少。蛋白印迹及免疫组化的结果显示，各造模组大鼠股骨OPG的表达均较正常对照组和假手术组降低，给予骨化三醇和不同浓度肾安干预后能使OPG在骨组织中的表达水平升高，但以肾安2.25g/mL剂量用药对OPG的表达升高作用更为明显。给药后，不同浓度肾安组的肾功能均得到改善，且随着OPG水平的升高，骨密度的降低得到缓解，低钙、高磷、高PTH水平也明显改善。

中医学理论认为，“肾藏精，精生髓，髓成骨”，“肾主骨”（《素问·宣明五气》），“肾生骨髓”“肾充则髓实”（《素问·阴阳应象大论》），“肾为先天之本”，肾所藏之精，所主之液皆可化生骨髓，为“肾主骨”提供了物质基础。若肾精充实，则髓化有源，骨得其养而坚固有力、活动灵便；若肾不藏精，肾精亏虚，则“肾主骨”功能亦失职，骨髓化生乏源骨失其养，将会出现骨骼脆弱、腰背疼痛、胫酸膝软、容易骨折等症状，发为“骨痿”、“虚劳”、“骨痹”。肾与骨的密切联系体现在ROD的整个发病过程中，脾肾亏虚，气血不足，又水湿、湿热、湿浊、瘀毒等邪实为患，使得骨失所养、髓化乏源，而肾虚浊瘀是ROD的发病关键。因此，针对ROD的发病机制，补肾泄浊是治疗ROD的根本方法。

肾安颗粒组方中淫羊藿能补肾壮阳、益精健骨，已有研究表明淫羊藿总黄酮（主要成分为淫羊藿苷）可能通过增加成骨细胞OPG的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收[8]。淫羊藿还可以提高肾脏BMP-7蛋白的表达，并作用于骨组织，上调骨组织BMP-7的表达，发挥其诱导成骨作用，增加骨形成，对抗糖皮质激素所引起骨损害[9]。黄芪能补益肺脾，黄芪甲苷是黄芪的代表性活性成分之一，能减轻小管间质的损伤，抑制肾纤维化。大黄功能清湿热化瘀祛浊排毒，抑制肾脏高代谢，抑制系膜细胞增生，改善脂质代谢，从多方面延缓慢性肾衰竭。既往的动物实验显示肾安颗粒能抑制ROD模型大鼠骨组织FGF-23的表达和上调BMP-7的表达[10-11]。

本实验证实，肾安颗粒在改善肾功能的同时能上调残余肾模型大鼠股骨组织OPG蛋白表达，从而改善ROD模型大鼠骨代谢，推测其改善骨代谢途径可能与上调OPG表达有关，但具体调节机制还有待进一步研究。

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R692.05

A

1672-397X（2014）07-0071-04

邹新蓉（1972-），女，博士，副主任医师，研究方向：中医药防治肾病。frank_judy@163.com

2014-03-14

编辑：吴宁

国家临床重点专科建设项目（财社【2011】172号）；武汉市重点学科带头人项目（201051730560）；武汉市软科学研究计划项目（20107105038）