慢性乙型肝炎患者血清M65和M30水平与肝纤维化分期的关系

许丹丹孟冠敏姜 凯龚艳容

（1．浙江省立同德医院，浙江杭州 310012；2．浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州 310003）

慢性乙型肝炎患者血清M65和M30水平与肝纤维化分期的关系

许丹丹1孟冠敏1姜 凯1龚艳容2

（1．浙江省立同德医院，浙江杭州 310012；2．浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州 310003）

目的检测慢性乙型肝炎病毒感染后血清中M65和M30水平与肝脏继发性纤维化病变的关系。方法选择150例慢性乙型肝炎患者和100例健康对照者，检测慢性乙型肝炎患者和健康人群血清M65及M30水平，并对慢性乙型肝炎患者肝脏活检组织进行METAVIR纤维化分级以及TUNEL检测。结果慢性乙型肝炎患者血清M30水平（277±44.5）U／L和M65水平（520±56.7）U／L均显著高于健康对照组M30（95±22.8）U／L，M65（202±45.7）U／L（均P＜0.01）；在慢性乙型肝炎患者中M30及M65水平和肝纤维化有关，它们在血液中的浓度随着患者肝纤维化程度的加深而升高，肝纤维化F2级M30（442±67.9）U／L，M65（707±55.1）U／L；F3级M30（585±51.2）U／L，M65（774±63.2）U／L；F4级M30（611±42.1）U／L，M65（788± 59.4）U／L显著高于F0级M30（223±23.1）U／L，M65（433±34.7）U／L和F1级M30（242±41.3）U／L，M65（448±39.4）U／L（均P＜0.05）；慢性乙肝患者肝细胞凋亡指数随着肝纤维化程度的提高而增加，分别为F0级16.3±3.1，F1级16.9±2.8，F2级21.3± 3.6，F3级25.9±3.2，F4级28.0±3.7。结论血清M30及M65水平能提示慢性乙型肝炎患者肝纤维化的程度。

慢性乙型肝炎；肝纤维化；M30；M65

临床研究证实，丙型肝炎和非酒精性脂肪肝患者中，细胞凋亡的特异性标记物M65和M30的血清水平可以诊断和预测肝纤维化分期，且不受炎症和脂肪肝程度的影响［1］，但对慢性乙型肝炎患者是否也可起到同样的作用，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取150例2013年1月～2014年1月被确诊为慢性乙型肝炎的患者共150例作为慢性乙型肝炎组，其中男100例，女50例，年龄25～68岁，平均（38.5±11.3）岁，患者感染急性乙型病毒性肝炎病程超过半年且HBsAg，HBV DNA，HBcIgM有一种以上阳性为慢性乙型肝炎［2］；选取健康对照者100例作为对照组，其中男56例，女44例，年龄22～67岁，平均（35.5±10.2）岁。乙型肝炎患者的肝活检标本与血清均来源于浙江大学医学院附属第一医院。

1.2 仪器与试剂 M30－Apoptosense ELISA试剂盒及M65－Apoptosense ELISA试剂盒均购于瑞典Peviva AB公司；TUNEL试剂盒购于瑞士ROCHE公司。

1.3 方法

1.3.1 血清M65及M30水平检测 将血清标本或标准品50μL加入反应孔内，立即加入50μL生物素标记抗体37℃孵育1小时，之后用洗液将孔清洗5次，加入80μL的亲和链酶素－HRP，37℃温育30分钟。用洗液将孔清洗5次后每孔加入底物A、B各 50μL，37℃温育10分钟，加入50μL终止液，在酶标仪的450nm处读取吸光值，根据标准品的浓度和吸光值绘制标准曲线，计算血清中M30及M65的水平。

1.3.2 肝纤维化程度分级 乙型肝炎患者肝组织活检由专业的病理科医生进行METAVIR纤维化分级［3］（F0～F4）。F0为无纤维化；F1为肝门束扩大，但未形成间隔；F2为肝门束扩大，有小的间隔形成；F3为间隔很多，但无肝硬化；F4为肝硬化。

1.3.3 TUNEL检测肝活检组织凋亡 按肝纤维化程度（F0～F4）每级随机选取5例组织标本进行TUNEL染色：将标本浸入通透液中8～10分钟（通透液：0.1%TritonX－100溶于0.1%柠檬酸钠），生理盐水洗2次，待标本干后加50μL TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃温育1小时，生理盐水洗2次，待标本干后加50μL辣根过氧化物酶抗体于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃温育30分钟，生理盐水洗2次，加80μL DAB底物室温孵育10分钟，生理盐水洗2次，之后用苏木素复染几秒后立即用自来水冲洗。典型的阳性细胞核着色，棕黄色或褐黄色。在低倍镜下（×100）选取细胞分布均匀的视野，再在高倍镜下（×400）计数1000个细胞中的阳性细胞数，重复计数10个视野，计算阳性细胞数占计数细胞数的百分比，即凋亡指数（AI）。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。数据采用（±s）表示，P值计算采用非配对双边t检验以及单因素方差分析。

2 结 果

2.1 血清M30和M65水平 慢性乙型肝炎组血清M30水平（277±44.5）U／L和M65水平（520± 56.7）U／L均显著高于对照组M30（95±22.8）U／L和M65（202±45.7）U／L（P＜0.01），详见表1。

表1 两组血清M30和M65水平比较（±s，U／L）

表1 两组血清M30和M65水平比较（±s，U／L）

与对照组比较**P＜0.01

组 别nM30M65对照组10095±22.8202±45.7慢性乙型肝炎组150277±44.5**520±56.7**

2.2 乙型肝炎患者肝纤维化分级和血清M30、M65水平及肝细胞凋亡指数的关系 慢性乙型肝炎患者肝组织活检结果发现不同程度的肝纤维化（F0～F4），同时检测乙型肝炎患者血清M30、M65水平及肝细胞凋亡指数，结果如表2所示，随着肝纤维化程度的加深，相应的M30、M65水平也上升，同时M30／M65比值也随着肝纤维化程度的加深而增加，TUNEL检测结果也显示了肝细胞凋亡指数随着肝纤维化程度的加深而增加（见第458页彩图1）。不同肝纤维化程度患者M30／M65比值与肝细胞凋亡指数AI的相关系数为0.9957，提示慢性乙型肝炎患者血清的M30／M65水平比值与肝细胞凋亡程度呈正相关关系。

表2 肝纤维化分级与血清M30、M65水平及凋亡指数比较（±s）

表2 肝纤维化分级与血清M30、M65水平及凋亡指数比较（±s）

与肝纤维化分级F0比较**P＜0.01

肝纤维化分级nM30（U／L）M65（U／L）M30／M65AI（n＝5，%）F021223±23.1433±34.70.5216.3±3.1 F159242±41.3448±39.40.5416.9±2.8 F234442±67.9**707±55.1**0.63**21.3±3.6**F323585±51.2**774±63.2**0.76**25.9±3.2**F413611±42.1**788±59.4**0.78**28.0±3.7**

3 讨 论

乙型肝炎患者肝纤维化的病因来自于受乙型肝炎病毒感染的肝细胞组织在机体的免疫反应下死亡，之后又被修复，在反复的损伤和修复刺激下逐渐形成肝纤维化瘢痕，进而导致肝纤维化的进展，肝纤维化程度的不断加深将最终导致肝硬化甚至肝癌［4］。因此，准确地掌握慢性乙肝患者肝纤维化的程度对于判断乙肝进展的严重程度，确定治疗方案以及评估抗病毒治疗的效果有着至关重要的作用。肝活检一直以来都被认为是判断肝纤维化的金标准，然而肝活检作为一种侵入性诊断方法，尤其是当需要进行反复穿刺时，其可能引起的出血并发症大大限制了肝活检的应用。另外，肝活检只取大约1／50000体积的肝组织，如此微量的体积也大大增加了肝活检结果可靠程度的局限性［5］。因此，发展血清学诊断肝纤维化具有十分重要的意义。

本文发现相比于正常人，慢性乙型肝炎患者M30和M65水平明显提升，且呈现出不同程度的肝纤维化。M30抗原是肝细胞凋亡的血清学指标，它只在凋亡的肝细胞内出现，而不会出现在活的或坏死的肝细胞内，M30水平已经被报道可以用来鉴别单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎，并用来判断非酒精脂肪性肝炎的肝纤维化程度［6］。M65抗原则不论在肝细胞发生凋亡还是坏死，它都能在血清中被检测到［7］。因此，计算M30与M65的比值对评价肝细胞凋亡占肝细胞总死亡的比率有一定的意义，本文结果表明，随着肝纤维化程度的增加，M30／M65比值也相应增加，且M30／M65比值与肝细胞凋亡指数存在正相关关系，提示慢性乙型肝炎患者血清的M30／M65水平比值可以推测肝细胞凋亡情况和肝纤维化情况。通过联合测定M30与M65水平，并通过M30与M65比值辅助判断乙肝患者肝纤维化的程度，对于乙肝患者的治疗和预后将有十分重要的意义。对比肝组织活检，血清学检测乙肝患者肝纤维化，能大大减轻患者的痛苦，并减少并发症的发生。

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［3］Liao C C，Chen T Y，Huang T L，et al．The acoustic radiation force impulse elastography evaluation of liver fibrosis in posttransplantation dysfunction of living donor liver transplantation．Transplant Proc，2014，46（3）：876

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