大豆肽的制备、提取与结构鉴定研究进展

富校轶，高永欣，张佰荣，孙茂成，王舒然*

(1.吉林医药学院食品质量与安全教研室，吉林 吉林 132013;2. 吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林 吉林 132022)

·综 述·

大豆肽的制备、提取与结构鉴定研究进展

Progress on preparation，extraction and structure identification of soybean peptides

富校轶1，高永欣1，张佰荣2，孙茂成1，王舒然1*

(1.吉林医药学院食品质量与安全教研室，吉林 吉林 132013;2. 吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林 吉林 132022)

大豆肽是大豆蛋白质经过蛋白酶水解、微生物发酵后分离、提取获得的具有多种生物功能的低分子肽类。近年来，研究发现大豆肽具有易消化和低抗原性的特点，具有调节免疫、降胆固醇、抗疲劳、抗氧化等多种生物活性，因此，大豆肽成为食品领域研究和开发的热点。本文对大豆肽的制备、提取方法以及结构鉴定进行简要概述。

大豆肽；制备；提取；结构鉴定

近年来，肽类物质尤其是大豆肽由于具有特殊的营养和功能引起了国内外广泛的关注。大豆肽是由大豆蛋白经过蛋白酶作用或者微生物技术处理后，再经过分离、精制等特殊处理而得到的低聚肽混合物，还包括一些游离氨基酸、水、灰分和少量的糖分等。大豆肽一般是由3～6个氨基酸组成的低分子量肽，蛋白质含量为85%左右，氨基酸组成与大豆蛋白质大体相同，必需氨基酸含量丰富且平衡。大豆肽的平均分子量小于1 000，主要出峰位置在分子量为300～700[1]。大豆肽具有良好的生物活性，如：促进脂肪代谢、抗氧化、降血脂和抗血栓形成等；同时具有良好的营养特征和加工性能，大豆肽能促进微生物的生长发育和代谢，在醋、酱油、奶酪、发酵食品中添加大豆肽可以显著提高产品的品质和营养价值，并增强产品的口感风味，提高产品的生产效率等，此外，大豆肽还能用于生产酶制剂[2]。

大豆肽的生产制备已经成为大豆蛋白深加工的一个重要方向，国际上也有大型公司在生产大豆肽制品，我国目前大量的院校、企业、研究所开展了对大豆肽的研究，应用前景良好。

1 大豆肽的制备

目前大豆肽的制备方法主要有三种：化学水解法、酶水解法和微生物发酵法。不同的方法有各自的优缺点，最终得到的大豆肽的功能特性、纯度以及理化性质会有所不同，所以根据实际需要选择不同的制备方法尤为重要[3]。

1.1 化学水解法

化学水解法有两种：酸水解法和碱水解法，我们一般称为酸碱水解法。即采用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子肽链发生断裂，并形成小分子多肽物质。酸碱水解法较简单，并且生产成本低，但是存在一些缺点，比如水解没有特异性、工艺难控制、产品质量不稳定、氨基酸容易发生破坏、营养成分损失大和影响环境等。因此，化学水解法大多用在实验室的研究中，不适合于大规模的工业化生产[4]。

1.2 酶水解法

酶水解法是利用蛋白酶在适宜的pH和温度下进行大豆蛋白酶解反应，把大分子蛋白质降解为小分子肽。这种酶解法生产的大豆肽产品安全性高、蛋白质利用率高、易于被人体吸收利用、好控制，比化学水解法更具优势。

在酶解大豆蛋白的过程中，正确的选择蛋白酶是关键。如今蛋白酶的种类非常多，按水解方式一般分为如下几种：内切酶、外切酶和一些能够水解蛋白质酯键和酰胺键的酶。内切酶作用于蛋白质分子内部肽键(-CO-NH-)，将蛋白质水解成多肽，常见的内切酶有动物蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等；外切酶是作用于蛋白质或多肽分子氨基末端或羧基末端的肽键，而获得游离的氨基酸，外切酶非常重要的应用就是把肽链末端的疏水性氨基酸水解掉，降低多肽的苦味；水解酯键和酰胺键的蛋白酶作用位点随肽键种类而异，如胰蛋白酶的切点是羧基侧为碱性氨基酸的肽键，胃蛋白酶的切点是两端有芳香族氨基酸的肽键[5]。

陈洁等[6]研究了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶在不同温度、pH值、水解时间、酶浓度下水解大豆豆渣的最适酶解反应条件，结果发现：木瓜蛋白酶的最适水解条件是底物质量分数5%、酶浓度20 000 U/g，水解温度为50 ℃，pH 7，水解6 h，最大水解度可达87.31%；碱性蛋白酶的最适水解条件是底物质量分数5%、酶浓度20 000 U/g，水解温度为55 ℃，pH 9，水解3 h，最大水解度可达91.23%；中性蛋白酶的最适水解条件是底物质量分数5%、酶浓度15 000 U/g，水解温度为45 ℃，pH 7，水解8 h，最大水解度可达81.42%。Lee Jin Yeol 研究了不同预处理方法(热处理、酸处理)对大豆分离蛋白酶解产物水解度、氨基氮、氮溶指数、肽链长度的影响[7]。Chiang Wen Dee等采用酶的膜反应器能够连续生产大豆肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，有效消除了产物的干扰，因而提高了酶解效率[8]。并且采用氧化稳定指数(OSI)检测发现，大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化活性显著提高。

1.3 微生物发酵法

目前大豆活性肽的微生物发酵法被认为是最有效、最先进的方法。微生物代谢活动产生的混合酶能够催化生物活性肽的生成，同时微生物可借助多肽水解液提高生长及产酶能力，具有一定的协同作用，生产效率更高。该法生产的大豆肽不是简单地将大豆蛋白质切成小肽，而是将释放的小肽通过移接和重排，经过微生物作用对某些苦味基团进行修饰、转移和重组，使获得的大豆肽具有更好的溶解性，无苦味，增强其应用价值。目前应用较广的微生物主要有枯草芽孢杆菌、放线菌、乳酸菌、黑曲霉3350和保加利亚乳杆菌等。微生物发酵法制备大豆肽具有原料成本低廉、工艺过程简单、条件温和、发酵效率高、产品品质好等特点[3]。

钱森和等[9]通过单因素试验以及Box-Benhnken组合的响应面方法，建立了KH菌种组合3个影响因素与响应值(大豆肽含量)相互作用的数学模型。得到最优发酵条件接种量为27.95%，枯草芽孢杆菌与黑曲霉接种比例为2∶1，发酵温度为35.92 ℃，含水量为52.71%，发酵时间为48 h；在此优化条件下发酵豆粕实际产出大豆肽含量为8.73%，提高了6.02倍。

杨彩艳在高转化率条件下，通过测定枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉和他们的混合菌种对大豆肽转化率的影响中，发现用混合菌种发酵制备低分子量肽优于单菌种发酵[10]。

2 大豆肽的精制提取

2.1 超 滤

超滤(Ultrafiltration,UF)是一种利用膜的“筛分”作用进行膜分离的过程，即在一定的压力(一般为0.1～0.5 MPa)作用下，当含有大、小分子物质两类溶质的溶液流过被支撑的膜表面时，溶剂和小分子溶质将透过膜作为透过物被收集起来；大分子溶质则被膜截留而作为浓缩液被回收[12]。超滤技术具有耗用化学试剂少、工艺流程简单的优点，是一种较实用的技术手段。目前，国内外已经广泛应用超滤技术来分离纯化大豆肽，提高了大豆肽的品质。实际操作中超滤膜由于浓差极化、膜孔堵塞等问题会导致生产率降低，所以正确掌握操作条件和参数很重要。

孙月梅[11]研究发现，采用2 000 Da的超滤膜，超滤的最适条件是压力0.37 MPa、pH 6、温度44 ℃、时间100 min。在此超滤条件下的响应面分析预测值为29.099 12 L/(m2·h)。大豆肽的抗氧化作用得到了显著提高。采用超滤膜对大豆肽进行处理，能有效提高大豆肽中抗氧化活性成分的含量。Patrycja Puchalska等人利用超滤技术分离大豆肽，通过不同的截留分子量的膜过滤，能够分离出5 000～10 000、3 000～5 000、3 000以下等不同分子量的大豆肽，并进一步对他们进行抗氧化活性的测定[12]。陈山采用超滤技术处理大豆肽发酵产物，实验结果表明：超滤处理可以在不添加任何化学试剂的情况下直接从发酵产物中分离提纯出大豆肽纯化物[13]。发酵液的浓度对膜通量有影响，浓度越大，膜通量就越小，但如果以单位时间单位面积超滤膜所处理的大豆肽固形物含量来评价膜效能，较高的浓度更能发挥超滤膜的效能。由于超滤膜对大豆肽的选择性较好，超滤法在用于大豆肽分离提纯的同时，也可以作为一种检测手段用来分析发酵产物中组分的相对分子量分布，为评价大豆蛋白的酶解效率提供了一种简单、快捷的测定方法。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是采用颗粒十分细的高效固定相并结合高压泵输送流动相的原理，样品组分流过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，形成差速移动，从而达到有效分离样品的方法[14]。在活性肽的分离纯化中，反向高效液相色谱(RP-HPLC)通常作为最后一个纯化步骤使用，钟芳等人利用RP-HPLC对经DA201-C、Sephadex G-15分离纯化后的大豆ACE抑制活性肽进行进一步的分离纯化，以5%乙腈(含0.05%TFA)为A液，80%乙腈(含0.05%TFA)为B液，优化的洗脱条件为：0～10 min 0～20%B；10～30 min 20%～40%B；30～35 min 40%～100%B；35～38 min 100%～0B；38～45 min 100%A，并运用了分析型RP-HPLC再次纯化最高活性组分至单一峰，得到纯化大豆肽[15]。

2.3 正交轴逆流色谱法

正交轴逆流色谱( Cross-axis Counter Current Chromatography,Cross-axis CCC) 主要用于中等分子量(分子量>3 000)大豆肽的分离。与传统的高速逆流色谱的区别在于其螺旋管支撑件的自转轴与仪器公转轴是相互垂直的，在进行行星式运动时形成三维的不对称离心力场，这一特殊结构使其非常有利于亲水性溶剂系统固定相的保留，从而适用于大分子的生物样品的分离制备。正交轴逆流色谱在利用亲水性溶剂系统分离大极性化合物和双水相系统分离水溶性生物大分子等方面的应用具有明显的优势，正交轴逆流色谱已经成功地用在多种蛋白质、生物酶和多糖等大分子化合物的分离中[16]。逆流色谱是一种不用固态载体的液液分配层析法，它具有分离纯度高、样品回收率高、对样品无沾染吸附、溶剂用量少、适应性强、能兼作小量分析和制备提纯等优点。

魏芸[17]等发现：分别以12.5%PEG8000-25%磷酸氢二钾(质量比1∶1)的溶剂系统，以及正丁醇∶三氟乙酸∶水(120∶1∶160，V/ V)的溶剂系统，用下相作流动相，上相作固定相，采用500 r/min的转速和1 mL/min流动相流速对标准蛋白质及大豆肽进行分离。在分离度损失不大的基础上提高了进样量，证明了正交轴逆流色谱法用于制备的有效性。

2.4 凝胶过滤法

凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography)作为目前最广泛使用的肽分离方法之一，其特点是分离条件温和、样品回收率高、实验重复性高、操作时间短、设备简便经济等，也是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。

利用凝胶过滤法提取分离经过酶解的大豆肽溶液，过SephdexG-25凝胶层析柱(1.0 cm×80 cm)。用大豆肽溶液洗脱，控制流速在220 nm处测定吸光度，收集色谱图中峰洗脱液，冷冻干燥，即得到大豆肽各组分，从而进行下一步的鉴定[18]。

3 大豆肽的结构鉴定

大豆肽的结构鉴定可以采用氨基酸分析仪法、DNA转录法和质谱法等。

氨基酸分析仪对样品的纯度要求非常高，难度大，比如氮端有封口，或者肽链中存在改性氨基酸和疏水性很强的肽段均会使测定中断或者产生错误，所以一般认为此种方法只是在少量的测定步骤内才有效[19]。DNA转录法首先要得到与被测肽段对应的基因片段，通过分析该基因片段的碱基序列，然后再将它转译为对应的氨基酸序列段，这种方法显然适合大分子长链的蛋白质，对于短的肽链效果并不好。质谱法作为一种蛋白质、肽链和氨基酸检测的手段，是目前最有效的方法，同时是国内外研究最热的技术。质谱法用于蛋白质和多肽的测序是近年来非常具有开创性的进展之一，作为一个新的研究领域，质谱可以作为将各种蛋白质与序列数据库联系起来的桥梁，成为鉴定蛋白质及多肽的首选方法，质谱具有快速性、高敏感性等许多优点，尤其适合多肽物质的鉴定。生物质谱根据质量数和所载电荷数不同的多肽片段在磁场中产生不同轨道而以质核比(M/Z)的方式来分离它们。1980年以来发展起来的电喷雾电离技术和基质辅助激光解吸-离子化-飞行时间质谱使质谱技术在蛋白质结构分析上的应用发生了革命性的飞跃[20]。

电喷雾离子化质谱(ESI-MS)是近几年迅速发展并逐步完善起来的一种电离质谱，特别适用于极性大、热不稳定的天然化合物的分析，它已经成功应用于多种类型的质量分析中。因其具有高特异性、高灵敏度以及多级质谱等技术特点，故可以直接进行混合物的微量分析。电喷雾离子化质谱可产生多价离子化的蛋白或多肽，允许相对分子质量达100 000的蛋白质进行分析，分辨率在 1 500～2 000 amu，精确度能达到0.01%。

连续流快原子轰击质谱(cf-FAB)是近几年发展起来的新方法。cf-FAB是一种弱离子化技术，可将肽类或小分子蛋白离子化成MH+或MH-形式，主要应用于肽类的分离检测，具有中等分辨率。

基质辅助激光解吸-离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS) 是目前蛋白质鉴定中精确测定分子质量的手段之一，特别适合对混合蛋白和多肽类物质的相对分子质量的测定，其灵敏度和分辨率较高。它同时结合液相色谱的联用技术可以高效率地鉴定多肽物质，适合分析绝大多数蛋白质，特别适合分析多肽类和大分子蛋白质的混合物。

核磁共振(NMR) 由于图谱信号的纯数字化、过度的重叠，范围过宽(由于相对分子质量太大)，核信号弱等原因，所以在蛋白和多肽物质的分析中应用不多。随着二维、三维以及四维 NMR 的应用，以及分子生物学、计算机处理技术的发展，使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。

有些情况，单一的分离、检测方法不能满足要求，因此研究时会结合实际情况，将不同的分离方法联合起来使用，并利用不同的结构鉴定方法，如钟芳等人运用RP-HPLC制备和纯化后得到的大豆ACE抑制活性肽，最后通过LC-MS液质联用技术测定出其组分的序列结构，经过LC-MS序列分析，降血压组分9-I的分子质量为772. 4，有三种可能的结构：VISTGAEP、VLSTGAEP和ANSAGTVGP。Kim Soo Yong 等人将酶解蛋白鱼骨物过SP-Sephadex C-25，再过 Sephadex G-25柱然后采用RP-HPLC 进行纯化，得到了抗氧化活性最强的肽段。还依次采用离子交换柱将鳕鱼酶解物进行分离，筛选出抗氧化活性较高的肽段，并利用制备型和分析型RP-HPLC进行分离纯化，最后用Q-TOF ESI质谱测定出抗氧化活性最高的肽的氨基酸序列为 Glu-Ser-Thr-Val-Pro-Glu-Arg-Thr-His-Pro-Ala-Cys-Pro-Asp-Phe-Asn[21]。

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1673-2995(2014)01-0051-04

富校轶(1971-)，女(汉族)，高级工程师,硕士.

王舒然(1968-)，男(汉族)，教授，博士.

TS255.1

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2013-12-16)