RT-qPCR技术在前列腺癌诊断中的应用The RT-qPCR technology in the diagnosis of prostate cancer

李 瑶，赵良中，方 芳 (吉林医药学院检验学院病原教研室，吉林 吉林 132013)

前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，95%以上的前列腺癌是发生于前列腺腺体组织的腺癌。前列腺癌的发病率具有明显的地理和种族差异。2011年美国前列腺癌新发病例数为240 890例，死亡病例数33 720例，在美国男性癌症相关死因中位居第2。同大部分亚洲国家一样，我国前列腺癌的发病率并不高，但由于环境污染及人口老龄化等因素的作用，近年来我国前列腺癌的发病率有明显的上升趋势。前列腺癌常发生于前列腺的周边带，起病较为隐匿，生长较缓慢，早期前列腺癌可无任何预兆症状，一旦出现症状，常属较晚期的进展性前列腺癌，甚至会出现转移症状，导致并发症和死亡率的升高[1-3]。因此，早期、合理、高效的诊断方法，对前列腺癌治疗显得尤为重要。实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)技术，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。RT-qPCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等[4-5]， RT-qPCR技术在前列腺癌诊断中亦有应用，本文就RT-qPCR技术检测与前列腺癌关系较密切的三个肿瘤标志物：前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、α-甲基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)及前列腺癌基因3(PCA3)的应用进展综述如下。

1 RT-qPCR检测前列腺癌患者体液中PSMA

PSMA 是一种II型跨膜糖蛋白,人PSMA基因全长62 035 bp,定位于染色体11P1-P2,分量约为10 000，由前列腺上皮细胞分泌[6-7]。PSMA是一种多功能蛋白，不仅具有多种蛋白酶活性,参与营养物质的摄取及跨膜信号的转导和细胞的内化作用[8-9]。前列腺癌早期阶段就有癌细胞进入血循环，外周血中的PSMA mRNA 的检测将有助于早期诊断及前列腺癌血行播散的判断。Beckett ML等[10]运用高灵敏度的RT-qPCR方法检测PSMA在前列腺癌及其转移灶中表达增高，其组织特异性明显。患者外周血中新型PSMA剪接变异体的检测有助于前列腺癌的诊断，采用RT-qPCR方法检测新型剪接变异体PSM-E，不仅有助于前列腺癌的诊断，还可以区分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌[11]。采用RT-qPCR方法检测新辅助治疗后前列腺癌淋巴结微转移淋巴结抽吸液内PSMA mRNA基因表达，为前列腺癌术前临床分期提供可靠的诊断依据，避免病理检查难以发现变性的前列腺癌细胞，以及影像学检查难以发现的病灶[12-13]。尿液中利用RT-qPCR检测PSMA是否有意义有待于进一步研究。在治疗方面，利用构建shRNA-PSMA慢病毒载体，转染前列腺癌细胞株LNCaP，结果对PSMA mRNA表达产生抑制，并且抑制率为60%，为后期研究前列腺癌免疫导向治疗提供了实验基础。人PSMA基因片段能够在酿酒酵母中诱导表达并进行翻译后糖基化修饰,为抗前列腺癌PSMA疫苗的研制奠定了良好基础[14-15]。

2 RT-qPCR检测前列腺癌患者体液中的AMACR

AMACR基因定位于5号染色体5p13.2 q11.1，编码198～382个氨基酸残基的相应蛋白，AMACR蛋白存在多种亚型，主要存在于线粒体和过氧化物酶体中。AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。AMACR亦可用作其他癌症的诊断标志物。对各种癌症细胞进行检查后发现，结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤都过度表达AMACR，以结肠直肠癌和前列腺癌表达最高[16-18]。尿液中AMACR mRNA的表达量可以作为前列腺癌诊断的一种非损伤性指标，前列腺穿刺活检前收集前列腺按摩后的尿液，离心后，用RT-qPCR检测尿液中AMACR mRNA的含量，其表达较高，对前列腺癌的早期诊断有潜在的临床价值。同时利用RT-qPCR检测前列腺癌中AMACR mRNA的表达，其表达诊断前列腺癌的敏感度和特异度较高，分别为81.3%和86.7%。然而前列腺癌组织中AMACR mRNA表达量与不同临床分期和病理分级之间关系则不具有统计意义[19-20]。Sreekumar等[21]通过蛋白质芯片、免疫印迹和ELASA三种技术方法分别对前列腺癌患者和对照组进行血清AMACR检测，结果显示前列腺癌患者血清AMACR浓度明显高于对照组。RT-qPCR检测前列腺癌患者血清中的AMACR未见报道。AMACR mRNA在前列腺组织中的表达对前列腺癌的诊断具有一定的临床应用价值。AMACR是对现有前列腺癌诊断方法的重要补充，AMACR可大大提高前列腺癌的诊断准确性。

3 RT-qPCR检测前列腺癌患者体液中的PCA3

PCA3基因是1999年bussemakers等发现的一种前列腺癌特异基因，该基因位于人类染色体9q21-22,全长约25 kb。Hessels等[22]检测了正常肾、膀胱、前列腺等组织及外周血淋巴细胞中PCA3 mRNA拷贝数，结果发现除前列腺外，其他组织都为阴性；同时还对108例PSA>3 μg/L的患者行前列腺穿刺活检，用RT-qPCR检测前列腺穿刺活检组织中的PCA3 mRNA，发现在前列腺癌中，癌细胞数大于10%的前列腺癌标本的PCA3 mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的66倍。癌细胞数少于10%的前列腺癌标本的PCA3 mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的11倍。因此该基因在前列腺癌细胞中特异性表达，正常前列腺细胞，前列腺增生的细胞中不表达或者仅少量表达。Landers等[23]用RT-qPCR检测前列腺癌组织中的PCA3 mRNA表达，证实前列腺癌组织中PCA3是良性前列腺增生组织的140倍。由此可见，PCA3特异性高表达于前列腺癌细胞，在正常前列腺或良性前列腺增生组织中不表达或低表达，在其他正常组织、血液或其他肿瘤标本中不表达。Deras等[24]对570例拟行前列腺穿刺活检患者进行尿液PCA3 mRNA检测，定量分析PCA3，其值与前列腺癌活检阳性率直接相关。尿液PCA3基因检测对前列腺癌早期诊断及前列腺癌预后的监测有重要意义。PCA3适合作为前列腺癌特异性标志物，在临床上，用RT-qPCR方法检测患者血液、前列腺按摩液、精液或前列腺按摩后尿液，能准确量化PCA3 mRNA水平，预测前列腺穿刺活检结果，作为一种非侵入性检测方法，能显著提高前列腺癌诊断的灵敏性、特异性和准确性。由于PCA3 mRNA具有较高的敏感性和特异性，这使得有可能在大量正常前列腺细胞存在的背景下检测出少量癌细胞,也可用于体液如血液、精液、尿液和前列腺按摩液中少量癌细胞的检测。在前列腺癌靶向治疗方面，Schalken等[25]研究分析了PCA3启动子结构积转录起始因素，发现PCA3的前列腺癌具有特异性，可致前列腺癌细胞死亡，而非恶性前列腺细胞及其他人体正常组织细胞不受影响。

4 结语及展望

前列腺癌是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家发病率极高,在高龄男性仅次于肺癌，在我国随着人均寿命的不断增长,近年发病率迅速增加。前列腺癌多数无明显临床症状,常偶然被发现，或者在前列腺增生手术标本中被发现。临床发现，大多数前列腺癌患者发现时已经处于晚期,失去治疗的最佳时机,并且预后不良容易复发。目前主要用直肠指检联合血清PSA 测定对前列腺癌患者进行初步的筛选,然后对阳性患者进行反复的穿刺活检,最后才能确诊。血清PSA 的水平容易受到多种因素的影响，而且前列腺增生和前列腺炎也可以引起血清PSA 水平的升高，容易产生假阳性结果，而导致不必要的穿刺，反复的穿刺不仅增加病人的痛苦而且可能导致其他并发症。因此迫切需要寻找新的前列腺癌特异性的肿瘤标志物，以提高前列腺癌诊断的特异性。近年来发现一些新的主要的前列腺癌肿瘤标志物如PCA3、AMACR及PSMA等。PCA3、AMACR及PSMA对前列腺癌的早期诊断及指导治疗具有十分重要的意义，应用前景广阔。三者在前列腺癌诊断，特别是早期诊断中能否成为联合检测的分子标志物，在前列腺癌治疗领域里能否根据基因序列特点，能否设计靶向基因疫苗，能否联合靶向治疗晚期前列腺癌患者，能否可以成为判断前列腺癌预后的联合指标，均有待于进一步研究。

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