五味子乙素对乳鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制

刘 威,张成义,沈 楠,金 宏,袁 瑞,万晓明,齐 玲

(1.吉林医药学院实验中心,吉林吉林 132013;2.北华大学药学院药理学教研室,吉林吉林132001; 3.吉林医药学院病理学教研室,吉林吉林 132013)

五味子乙素对乳鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制

刘 威1,张成义2,沈 楠1,金 宏1,袁 瑞1,万晓明1,齐 玲3

(1.吉林医药学院实验中心,吉林吉林 132013;2.北华大学药学院药理学教研室,吉林吉林132001; 3.吉林医药学院病理学教研室,吉林吉林 132013)

目的:探讨五味子乙素(Sch B)预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响,并探讨其可能机制。方法:分离培养原代乳鼠心肌细胞,将其分为对照组、模型组和10、50、250 mg·L－1Sch B预处理组,除对照组外各组细胞采用2 mmol·L－1Na2S2O4培养2 h后换用正常培养液培养18 h,造成心肌细胞H/R损伤。倒置显微镜观察各组心肌细胞形态学变化,MTT法检测各组细胞存活率,检测各组细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,模型组细胞明显回缩、停搏或浮起,细胞存活率明显降低(P＜0.01),LDH和CK活性及MDA水平升高(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);与模型组比较,SchB预处理各组细胞博动尚存,回缩较轻,细胞存活率明显升高(P＜0.01), LDH和CK活性及MDA水平降低(P＜0.01),SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。结论:Sch B对乳鼠H/R损伤的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与其抗脂质过氧化作用有关。

五味子乙素;心肌细胞;缺氧/复氧损伤;抗氧化

心肌缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤是指H/R心肌在恢复血运后原损伤反而加重,一般发生于再灌注后24 h内。H/R损伤常导致心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常以及心肌超微结构改变[1]。随着血管再通技术的迅速开展,心肌H/R损伤成为影响疗效和阻碍治疗的最主要原因,如何减轻H/R损伤成为医学界新的挑战[2]。有文献[3-6]报道:五味子各成分具有抗心肌H/R损伤作用,但具体作用机制尚不清楚。本研究采用耗氧剂连二亚硫酸钠(Na2S2O4)制备原代培养心肌细胞H/R损伤模型,检测其乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平,探讨五味子乙素(schizandrin B,Sch B)对H/R损伤心肌细胞的保护作用及其可能机制,为新药开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器出生72 h内的SD大鼠,由吉林大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK-吉2007-0003。Sch B(中国药品生物制品检定所),DMEM粉剂培养基(美国Gibco公司),MTT和胰蛋白酶(美国Sigma公司),新生牛血清(四季青公司产品),LDH试剂盒、CK试剂盒、SOD试剂盒和MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。CO2培养箱(美国Shell公司), Motic AE37摄像倒置显微镜和860型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 乳鼠心肌细胞原代培养取新生72 h内的SD大鼠乳鼠4～8只,剪取心脏,冷PBS溶液冲洗3次,50 m L离心管中剪碎。PBS冲洗2次, 以0.25%胰蛋白酶37℃消化8 min,收集上清,用血清终止消化,反复消化至组织块消化完全。整个消化过程控制在1.5～2.0 h内。收集液以200目滤网过滤,1 000 r·min－1离心5 min,去上清,重悬,差速贴壁90 min纯化细胞后调整密度为1×105～1×106m L－1,接种于细胞培养板中, 96孔板每孔200μL。

1.3 实验分组及处理方法对照组:细胞正常培养,不加任何处理;模型组:将正常培养液换为终浓度为2 mmol·L－1的Na2S2O4溶液,细胞缺氧培养2 h后换正常DMEM培养液即造成H/R损伤,CO2培养箱内继续培养18 h。不同浓度Sch B预处理组:在培养液中加入终浓度为10、50和250 mg·L－1Sch B溶液预培养24 h后同模型组处理。

1.4 心肌细胞形态学观察倒置显微镜下观察各组心肌细胞的生长状态,包括细胞贴壁情况、伸展程度、搏动的频率和同步性。

1.5 MTT比色法测定心肌细胞存活率各组心肌细胞PBS清洗2次,加入无血清的培养液及20μL MTT溶液,继续培养4 h。倒板后每孔加入150μL二甲基亚砜,震板10 min,酶标仪570 nm处测定吸光度(A)值,计算细胞存活率。细胞存活率＝实验组A值/正常组A值×100%。

1.6 心肌细胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平测定各组心肌细胞H/R损伤后,按照试剂盒说明书操作,取培养液上清,测定LDH漏出量及CK活性。取各组细胞,经超声波破碎仪(功率300 W,工作时间3 s,间隔时间30 s,重复5次)将其破碎,按试剂盒说明操作,测定胞浆中MDA水平和SOD活性。

1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率,LDH、CK、SOD活性和MDA水平以±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组心肌细胞形态学表现与对照组(图1A,见插页三)比较,模型组细胞体积回缩明显,仅少数细胞搏动30～40次·min－1,搏动不规则甚至停止,有大量单个细胞浮起甚至部分区域细胞层浮起,表明细胞损伤严重(图1B,见插页三)。与模型组比较,Sch B预处理各组的心肌细胞H/R损伤后,随药物浓度增加心肌细胞形态变化不同程度减轻;250 mg·L－1Sch B预处理组细胞轻度回缩,伪足尚存,搏动90～110 min－1,频率较规整,同步性较好,无细胞浮起或细胞层脱落(图1C,见插页三);50 mg·L－1组细胞回缩较明显,部分细胞伪足消失,细胞连接减少,搏动80～100 min－1,出现不规律搏动,无细胞浮起或脱落(图1D,见插页三);10 mg·L－1Sch B预处理组细胞回缩明显,较多伪足消失,搏动约为70 min－1,有较多不规则搏动,同步性较50和250 mg·L－1预处理组差(图1E,见插页三)。

2.2 各组心肌细胞存活率与对照组(95.75%± 2.62%)比较,模型组心肌细胞存活率(70.67%± 2.55%)明显下降(P＜0.01),细胞损伤严重;与模型组比较,10、50和250 mg·L－1Sch B预处理组细胞存活率(78.43%±3.53%、83.64%± 2.03%和89.77%±3.42%)均明显上升(P＜0.01)。上述结果表明10～250 mg·L－1Sch B对心肌细胞H/R损伤有保护作用,且呈浓度依赖性。

2.3 各组心肌细胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平模型组细胞H/R损伤严重,与对照组比较,LDH和CK活性及MDA水平明显升高(P＜0.01),SOD活性明显降低(P＜0.01);与模型组比较,Sch B预处理各组LDH和CK活性及MDA水平明显降低(P＜0.01),SOD活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01);10、50和250 mg·L－1Sch B预处理组随着Sch B浓度增加LDH和CK活性及MDA水平明显下降(P＜0.05),SOD活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 各组心肌细胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平Tab.1 Activities of LDH,CK and SOD and MDA levels in myocardial cells in various groups(n＝6,±s)

∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with model group;＃P＜0.05,＃＃P＜0.01 compared with 10 mg·L－1Sch B group;▲P＜0.05 compared with 50 mg·L－1Sch B group.

Group LDH [λB/(U·L－1)] CK [λB/(U·m L－1)] SOD [λB/(U·mg－1prot)] MDA [mB/(μmol·g－1prot)] Control 123.20±18.84 0.37±0.03 20.97±2.29 2.48±0.40 Model 425.89±22.98∗0.60±0.07∗10.17±1.83∗5.45±0.32∗Sch B(mg·L－1) 10 350.65±33.25△△0.49±0.02△△12.03±1.87△4.84±0.30△△50 260.54±30.69△△＃0.44±0.02△△＃14.43±1.46△△＃4.18±0.15△△＃250 203.16±9.78△△＃▲0.41±0.01△△＃▲17.20±1.16△△＃＃▲3.86±0.33△△＃▲

3 讨论

心肌组织的有氧代谢与线粒体功能关系密切。研究[7-9]表明:缺血再灌注、活性氧的积累和钙超载等情况均可造成线粒体膜通透性增高和酶外漏,使其功能下降或丧失,引起细胞坏死。LDH是线粒体内重要酶,其水平改变会干扰心肌细胞正常代谢,造成心肌细胞大量损伤和死亡,其漏出量多少直接反映细胞损伤程度,因此可将其作为反映心肌细胞损伤程度有效指标[10]。CK是人体能量代谢过程中的重要酶类,通常存在于骨骼肌和心肌组织细胞浆和线粒体中。正常情况下,血清CK活性很低,当细胞损伤时,细胞膜遭到破坏,CK可从细胞内释放出来,临床上常以CK及其同功酶作为骨骼肌和(或)心肌损害敏感指标[11]。在心肌缺血/再灌注损伤发病机制中,自由基(oxygen free radical,OFR)引起的损伤起着关键作用。许多缺血性心脏疾病如心肌梗死和心力衰竭发生时,大量氧自由基可导致心肌细胞膜脂质过氧化,膜结构破坏,细胞渗透性改变,引起心肌细胞凋亡和坏死[12-14]。机体为了对抗氧自由基对自身的损伤,形成了完整的氧自由基清除系统,其主要成分是机体中的抗氧化酶。SOD是这个清除系统中重要的抗氧化酶,其活性高低可反映机体对氧自由基的清除能力[15]。正常状态下氧自由基生成系统与清除系统处于动态平衡之中。当组织细胞受到损伤时,该动态平衡被破坏,因为ATP等能量物质大量耗竭可使该酶系遭到破坏,清除能力降低,大量来不及清除的OFR聚积;再灌注时,造成氧自由基爆发性释放,严重影响物质代谢,损害机体,引起疾病[10]。OFR还可攻击细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸,生成多种脂质过氧化物,如MDA等大量细胞毒性物质。MDA对细胞膜有很强破坏作用,使其流动性降低和通透性增高,细胞内外离子分布发生异常,影响细胞信号转导系统,抑制心肌细胞功能,最终导致心肌细胞从可逆性损伤发展为细胞死亡,故MDA可作为脂质过氧化反应强弱的指标[16-17]。

本研究结果显示:H/R损伤后模型组培养液中LDH和CK活性明显增加,与对照组比较差异有统计学意义,这与细胞膜破坏导致其外漏有关; 10、50和250 mg·L－1SchB预处理组培养液中LDH和CK活性明显下降,与模型组比较差异有统计学意义,说明Sch B预处理可减轻细胞损伤,其机制与保护心肌细胞膜结构和功能有关。同时本研究结果显示:与对照组比较,模型组SOD活性明显降低,MDA水平明显升高,说明心肌细胞清除氧自由基能力严重下降,大量氧自由基对细胞剧烈攻击,产生了大量脂质过氧化产物,细胞受到严重损伤;与模型组比较,10、50和250 mg·L－1Sch B预处理组SOD活性均明显升高,MDA水平明显下降,说明Sch B预处理可减轻心肌细胞氧化损伤。

综上所述,Sch B对H/R损伤心肌细胞的保护机制与其保护心肌细胞膜完整性、减少LDH和CK的外漏、提高SOD活性、减少MDA的生成,从而减轻细胞氧化损伤,使心肌细胞处于功能活跃状态的作用有关。因此,Sch B可以作为保护心肌细胞的新药进行开发,但其对H/R损伤心肌细胞保护作用的其他机制还有待进一步研究。

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Protective effect of Schisandrin B on myocardial cells with hypoxia/reoxygenation-induced injury in neonatal rats and its mechanism

LIU Wei1,ZHANG Cheng-yi2,SHEN Nan1,JIN Hong1,YUAN Rui1,WAN Xiao-ming1,QI Ling3
(1.Experimental Center,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Department of Pharmacology, School of Pharmacy,Beihua University,Jilin 132001,China;3.Department of Pathology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo investigate the influence of Schizandrain B(Sch B)preconditioning in myocardial cells of neonatal rats with hypoxia/reoxygenation(H/R)injury,and to explore its possible mechanism.MethodsThe cultured myocardial cells were divided into control group,model group and 10,50,250 mg·L－1SchB preconditioning groups.All the cells in various groups except control group were cultured in 2 mmol·L－1Na2S2O4for 2 h,then cultured in normal medium for 18 h to induce myocardial H/R injury.The morphological changes of myocardial cells in various groups were observed under inverted microscope.The survival rates of the myocardial cells in each group were examined by MTT.The activities of lactic dehydrogenase(LDH),creatine(CK), superoxide ismutase(SOD),and the(MDA)levels in the cells in various groupswere examined by detection kits.ResultsCompared with control group,the cells in model group were retracted,arrest or float,the survival rate was decreased significantly(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA level were increased(P＜0.01),andthe SOD activity was decreased(P＜0.01);compared with model group,the cells in Sch B preconditioning groups remained beating,retraction was light,the cell survival rates were significantly increased(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA levels were decreased(P＜0.01),and the SOD activities were increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionSch B has protective effect on myocardial cells with H/R injury in the neonatal rats,which may be associated with anti-oxidative damage.

Schisandrin B;myocardial cells;hypoxia/reoxygenation injury;anti-oxygenation

R285.5

A

2013-09-25

吉林省教育厅科研基金资助课题(2011281,2012330,2012329)

刘 威(1976－),女,吉林省吉林市人,助理实验师,医学硕士,主要从事心肌细胞缺氧/复氧损伤的研究。

齐 玲(Tel:0432-64560027,E-mail:qiling1718＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0977-04

10.13481/j.1671-587x.20140514