根管封闭剂生物安全性评价方法及其应用的研究进展

朴维英,陈 路,王成坤

(吉林大学口腔医院牙体牙髓病科,吉林长春 130041)

根管封闭剂生物安全性评价方法及其应用的研究进展

Progress research on evaluation methods of biological safety and application of root canal sealer

朴维英,陈 路,王成坤

(吉林大学口腔医院牙体牙髓病科,吉林长春 130041)

根管封闭剂临床应用前应进行生物安全性评价,客观检验和评价根管封闭剂的生物安全性、选择生物相容性高的材料应用于临床一直是牙体牙髓病学领域的研究热点。本文对根管封闭剂生物安全评价的必要性及其常用实验细胞和实验方法进行综述。

根管封闭剂;生物安全性;细胞实验

研究[1]证明:根管封闭剂的溶解产物能以半抗原的形式对根尖周组织产生影响,最终导致根管治疗的失败。临床应用的根管封闭剂种类繁多,旨在通过改变理化性质和充填方式提高根管封闭性能。但是,近年来随着根充后疼痛的不断出现,根管封闭剂临床应用前的生物安全性评价受到人们的高度关注。体外细胞毒性实验是根管充填材料生物学评价的筛选实验之一[2]。当前,有关细胞毒性的定义尚无定论,一些学者将其等同于体外毒理,更多学者将其定义为外界毒物所致细胞数量的改变[3]。本文作者采用后一种观念,就根管封闭剂生物安全性评价的必要性及细胞毒性实验的相关内容进行综述。

1 生物安全性评价的必要性

根管充填的目的是通过严密的充填将机械及化学预备未能清除的细菌隔绝在根管系统内,同时阻断根尖周的细菌进入根管,防止其再感染[4]。因此,近年来出现很多旨在提高根管封闭性能的根管充填材料,如环氧树脂类根管封闭剂EZ-Fill,其特殊的双向螺旋输送器可将封闭剂甩入侧副根管内,以求达到根尖3 mm良好的封闭[5];硅酮类根管封闭剂Roeko Seal利用自身良好的流动性和固化后0.2%体积膨胀达到根管封闭的效果[6]。

迄今为止,应用最广的充填材料为马来胶,其具有轻微的抗菌性能和一定程度的组织刺激性。Cardoso等[7]发现:将马来胶植入Wistar大鼠皮下,8和60 d组大鼠均出现轻微的炎症反应,这可能与其高含量的氧化锌有关。常用的根管封闭剂有氧化锌丁香油水门汀类、氢氧化钙类、玻璃离子类和树脂类。氧化锌丁香油糊剂(ZOE)虽然有抑菌、安抚和麻醉的作用,但与牙胶、根管牙本质无粘接性,与水反应溶解出Zn2＋,根管封闭性能差[8]。此外,已经证实该类根管封闭剂固化后释放甲醛,细胞毒性较大[9],且毒性呈剂量依赖性,随着丁香油量的增加毒性增加,延缓根尖周组织病变愈合甚至再次引发根尖周组织病变[10]。基于以上不足,ZOE已逐渐退出主流应用。氢氧化钙类根管封闭剂具有良好的生物相容性,可促进根尖周骨质的愈合。但有实验[11]表明:大量Ca2＋的释放可引起细胞毒性;且由于氢氧化钙的电离,导致封闭剂溶解,完整性破坏,根尖封闭性降低[12],故不适合用于成人的永久根管充填,主要用于盖髓术、根尖诱导成形术和根管消毒等。玻璃离子类根管封闭剂中的玻璃离子与牙体组织羟基磷灰石中的钙产生化学螯合作用,具有一定的化学粘结性。Ketac Endo是一款可注射型玻璃离子类封闭剂,表面张力低,流动性好,曾于20世纪80年代较多应用于国外临床。有实验[13-14]表明:Ketac Endo具有良好的生物相容性,但与牙胶(0.19 Mpa)和牙本质(0.8 Mpa)粘接较弱[15],且持续释放氟离子,溶解性大,根尖封闭性差[16]。此外,因为尚无玻璃离子的溶剂,根管再治疗时难以将其去除,使得这类根管封闭剂使用较少。

目前国内临床常用的树脂类根管封闭剂是环氧树脂类根管封闭剂AH-plus,能与牙本质形成良好的粘结[17],能明显提高根尖封闭性,但与牙胶尖之间的惰性结合使其无法避免牙胶尖与封闭剂界面的微渗漏。近年来出现了生物陶瓷类根管封闭剂iRoot-SP,被称为是生物相容性最好的材料。iRoot-SP以生物玻璃为基质,含有硅酸钙、磷酸钙、氢氧化钙和氧化锆等成分。可与牙本质小管内的水分发生水化反应固化[18],固化过程中有2%～3%的体积膨胀而达到根管系统的3D充填,固化后无体积改变,对牙本质小根管不会产生任何压应力。但对其细胞毒性的研究报道比较少。

由此可见,目前临床常用的根管充填材料的性能尚未达到Grossman理想根管充填材料的标准。在临床操作过程中,根管充填材料可能通过根尖孔及其他通道与牙周和根尖周组织接触,也可能释放一些毒性成分,对牙周和根尖周组织甚至全身健康产生影响。部分材料在混合初期,结固的几小时、几天或几周时有毒性,甚至有些材料渗出有害成分长达数年。因此,在临床应用前,对根管充填材料生物安全性评价的研究十分必要。

2 根管封闭剂生物安全性检测常用细胞

2.1 实验细胞种类用于根充材料细胞毒性实验的细胞分2种:一种是原代细胞系,如牙周成纤维细胞和成骨细胞、牙髓细胞和牙龈成纤维细胞等;另一种是已建株细胞系,如小鼠肺成纤维细胞(L929)、小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)及癌细胞等。原代细胞系能较好地模拟口腔状况,但提取和体外培养过程较复杂,不易培养传代。有实验[19]表明:采用消化培养法提取原代细胞时,胰酶消化会损伤细胞,消化时间超过20 min,可消化掉细胞表面的蛋白质,使细胞表面的通透性升高,活力下降。建株细胞系并非口腔细胞,与口腔环境有一定的差异,但容易生长传代、性质稳定。根据国际标准化组织的要求,已建株细胞作为材料毒性测试的靶细胞,简单易得、重复性好,且较原代细胞稍敏感,更适合于根管充填材料的细胞毒性实验,且二者差异对最终材料的毒性分级并无影响。Franz等[20]报道:原代牙龈组织纤维细胞和L929细胞用于细胞毒性实验,其结果并无较大差异。Huang等[21]用牙周成纤维细胞和V79细胞比较不同种类根充糊剂细胞毒性时发现:总体结果具有一致性且V79细胞更敏感。

2.2 实验细胞培养MTT实验细胞培养多采用单层细胞培养法。多层细胞培养方法复杂和难度大,其准确性、可重复性和适用范围有待于进一步核实。虽然Moharamzadeh 等[22]在检测树脂材料细胞毒性时,证实多层细胞培养在评估口腔材料安全性方面较单层细胞能更好地模拟实际环境。但Vajrabhaya等[23]在评估6种根充材料的细胞毒性时发现:多层细胞培养法对于评估根尖周组织无特殊意义。

3 根管封闭剂生物安全性评价常用细胞实验方法

3.1 同位素标记法同位素标记法包括有铬释放法、H3-leucine掺入法、I125-UdR-释放法和放射性核苷酸前体物掺入法等。该方法能较深入细致地了解细胞受材料毒性影响而产生的分子水平变化,但方法复杂、结果受较多因素影响,且与其他体外法无明显相关性[24]。

3.2 分子滤过法分子滤过法通过评价材料对单层细胞琥珀酸脱氢酶活性的影响以检测细胞毒性,用于短期内评价有轻度毒性的材料[25]。该方法可同时观察材料的原发性及继发性细胞毒性,快速简便、敏感可靠,易推广,但存在强行影响析出产物从材料中扩散的缺点。

3.3 流式细胞术该方法主要针对单一生物材料,分析材料对体外培养细胞生物合成方面的影响。利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列,按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光,检测器可逐个对细胞的荧光强度进行测定。根据荧光粒子发出的光量子而定量测定细胞中DNA水平,检测快捷而方便,便于分析,发展潜力大。

3.4 甲噻唑四唑氮(MTT)比色法MTT是一种黄色可溶性染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒颗粒并沉积在细胞中。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,通过测定其吸光度(A)值,可间接反映活细胞数量及细胞代谢活性的强弱。在一定细胞数范围内(200～5×105),MTT结晶形成的量与细胞数成确定的直线回归关系[26]。因此可利用A值降低程度反映材料析出液的细胞毒性大小。

国际上评价细胞毒性实验方法优劣的指标之一是生物学终点及可重复性。MTT法的生物学终点是线粒体,其病变是细胞受损最灵敏的指征,能十分灵敏地反映被测材料对细胞造成的毒性损害程度,且该方法操作简单,可重复性好,可用于大批量测试。其不足之处是必须使用材料的浸提液进行细胞毒性的测定。Grossman曾提出理想的根充糊剂应不溶于组织液。但大多数根充糊剂在一定程度上是可溶解的[27-28]。有研究[29]显示:新型根管封闭剂MTA Fillapex和Endosequence BC也有一定的溶解性。因此, MTT法测定根充糊剂的细胞毒性切实可行。

根管封闭剂细胞毒性测定的模块制作尚无统一标准,采用不同的标准(质量/体积;表面积/体积)将对实验结果产生影响。为了更好地模拟口腔实际情况,将实验材料分为2组,即新鲜组和固化组;首先按根充糊剂的产品说明制备糊剂,制作样本,新鲜组将制备后的糊剂立即置于浸提液中,固化组则静置一段时间,待材料凝固达到最终的的化学结构后再置于浸提液中;每种根管封闭剂有各自的凝固时间,这样分组可以测定每种根管封闭不同状态下的细胞毒性。一些研究[30-31]表明:细胞毒性效应取决于有毒性单体的释放。对于树脂类根充糊剂进行根管充填操作时,材料处于不完全聚合状态,在其聚合过程中很有可能释放亲水性的单体直接导致根尖周组织的损伤。树脂类材料的聚合不完全,凝固后材料的细胞毒性效应依赖于局部单体的浓度和洗脱动力学。Esteban等[32]比较4种甲基丙烯酸酯类树脂根充糊剂时发现:新鲜实验组细胞活性较凝固组差,但组内各材料细胞毒性的大小具有一致性。基于材料本身的理化性质,这种材料处理方式使实验结果更有说服力、更可信。

值得注意的是:采用浸提液的材料处理方法评价单一实验材料的细胞毒性时存在结果偏低的不足。Pereda等[33]证实:离子的扩散程度和作用时间呈线性关系,浓度分布随径向距离增大而减少。在一定体积的浸提液中,离子浓度达到临界值后,离子扩散相对停止。就时间依赖性而言,在某一时间点一定体积浸提液中有毒离子浓度是均一稳定的,不再随时间的变化而改变。而事实上,根充糊剂中的有毒成分会随着糊剂的溶解不断释放到根尖周组织,导致组织损害。液体均一稳定的性质,也无法体现毒性物质导致细胞损伤的径向依赖性,其忽略了距离材料近的地方毒性物质离子浓度大、细胞毒性也大的事实。但对于多种材料的细胞毒性比较实验则不存在这一问题,只要组内材料处理方式相同,不会影响实验数据的总体趋势,实验结果是可靠而有意义的。一些根充糊剂细胞毒性比较实验[10,34-35]均证实:AH-plus细胞毒性较低,生物相容性较好。

综上所述,任何根充材料均有一定的细胞毒性,根充材料的生物安全性评价十分必要。体外细胞毒性实验结果可以为临床应用提供参考依据,尽量选择细胞毒性小的材料以避免根充术后疼痛的发生和提高治疗成功率。体外细胞毒性实验的方法种类很多,MTT法操作简单、可重复性好,广泛应用于细胞毒性测定。在应用中应合理设计,避免干扰因素,降低实验误差,以得到可靠的实验结果。MTT实验有其自身的局限性,在评价单一根充材料的细胞毒性时,MTT实验结果只能作为初步判定依据,应结合其他实验以完善对根管充填材料生物安全性的评价。体外细胞毒性实验不能完全体现根管充填材料对根尖周组织产生的影响,应用时应进一步考虑其结果与临床应用的相关性。

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R781.33

A

2014-01-08

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20140414010GH)

朴维英(1987－),女,吉林省磐石县人,在读医学硕士,主要从事牙体牙髓病基础和临床方面的研究。

王成坤(Tel:0431-88975348,E-mail:wck1964＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1123-04

10.13481/j.1671-587x.20140542