CT定量反映非小细胞肺癌组织缺血坏死程度与葡萄糖代谢水平

徐炜，单秀红，胡慧，谌业荣，陈建华，丁国文，范钰，王亚非

（江苏大学附属人民医院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．肿瘤科，江苏镇江212002）

CT定量反映非小细胞肺癌组织缺血坏死程度与葡萄糖代谢水平

徐炜1，单秀红1，胡慧1，谌业荣1，陈建华2，丁国文3，范钰4，王亚非1

（江苏大学附属人民医院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．肿瘤科，江苏镇江212002）

目的：评价CT定量反映非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织缺血坏死程度及葡萄糖代谢水平的可行性。方法：选择52例NSCLC患者，测量患者术前早期增强CT图像上病灶的缺血坏死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）；免疫组织化学染色检测患者术后肺癌组织标本中葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）和碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达。结果：52例中，Glut 1表达0级、1级和2级的INCTQ分别为0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差异有统计学意义（F＝10．633，P＝0．000）；Glut1和碳酸酐酶Ⅸ无表达组、单表达组和共表达组的INCTQ分别为0．32±0．25、0．85±0．83和1．37±1．27，差异有统计学意义（F＝4．449，P＝0．017）。结论：NSCLC早期增强CT能较为准确地评价NSCLC的缺血坏死程度和葡萄糖代谢水平。

非小细胞肺癌；葡萄糖转运蛋白1；碳酸酐酶Ⅸ；X线计算机体层摄影术；缺血坏死

肿瘤细胞在恶变过程中最基础的代谢改变是糖酵解增强［1］。该现象是由于肿瘤生长速度过快，超过了肿瘤血管新生的速度，肿瘤细胞缺氧所致；肿瘤细胞通过缺氧诱导因子（HIF-1）表达增加，一方面促进肿瘤血管生成［2］，另一方面促进葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter protein 1，Glut1）表达，增加葡萄糖摄取，进行有氧氧化或无氧酵解，既能提供自身所需的ATP，又能利用糖酵解的中间产物进行生物合成［3］。Airley等［4］发现，在包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在内的多种肿瘤组织标本中，Glut 1主要在缺血坏死区周围高表达，为肿瘤组织坏死标志物。文献报道，Glut 1在NSCLC组织中阳性表达率达81．4%，其中鳞癌阳性表达率为100%，而且分期越晚，强阳性表达率越高［5］，与预后密切相关。碳酸酐酶是含锌金属酶，具有调节体液pH的作用，参与体内酸碱平衡调节及离子交换等过程。研究发现，碳酸酐酶Ⅸ主要在肿瘤坏死区周围表达［6］，为肿瘤组织坏死的另一生物标志物。早期增强CT可反映肿瘤的血管生成水平，但作为肿瘤的另一重要特征性表现——肿瘤组织的代谢水平能否被早期增强CT所反映，目前相关报道不多。CT成像密度分辨率高，根据其早期增强图像能够区分缺血坏死区，本研究拟通过早期增强CT对NSCLC病灶的缺血坏死区进行密度和面积的定量，探讨其与缺血坏死生物标志物表达水平的关系。

1 材料与方法

1．1 病例

收集江苏大学附属人民医院2010年12月至2013年5月，术前经本院CT检查的52例NSCLC病例，年龄39～87岁，平均61．6岁，男36例，女16例。其中，鳞状细胞癌18例，腺癌31例，腺鳞癌3例。图像存储和传输系统（PACS）保存有完整的CT图像资料，病理科有完整的石蜡包埋肺癌组织标本。

1．2 设备、材料及数据采集方法

CT系统型号为西门子Sensation 64层CT和PHILIPSBrilliance iCT 256层螺旋极速CT机；碘海醇注射液（碘含量300 mg／mL）为对比剂；兔抗人Glut1多克隆抗体购自美国Bioworld公司，兔抗人碳酸酐酶Ⅸ抗体购自美国芝加哥Proteintech公司，抗体链霉抗生物素蛋白、过氧化物酶及二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。病理组织石蜡切片机、切片摊片机、切片烤片机（常州中威电子仪器厂），电热恒温水浴箱（美国Pharmacia公司），CX41型光学显微镜、PX53型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），病理图像分析系统（金仕达卫宁软件股份有限公司）。

胸部CT扫描及重建方案：120 kV，120 mAs；胸部平扫，依照1．5 mL／kg的剂量肘静脉注射碘海醇，速率为3mL／s，延迟35 s全胸部扫描，2次序列容积数据采集层厚为0．5 mm或0．625 mm，轴位、冠状位及矢状位3 mm层厚纵隔模式重建增强序列的病灶层面。

缺血坏死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）测量：分别显示增强序列的3 mm层厚的轴位、冠状位和矢状位的病灶最大层面，显示窗位／窗宽为50／250，测量3层面密度明显较低区（缺血坏死区）的面积（SN）和CT值（HN）、其他非缺血坏死区的面积（SC）和CT值（HC）（图1），肿瘤病灶INCTQ值按如下公式计算：（HC÷HN）×（SN÷SC）。由3位主治以上影像科医师分别独立测量，取所得数据的平均值。

1．3 免疫组织化学试剂及染色计数方法

采用EnVision两步法对组织标本进行免疫组织化学染色，简要步骤如下：肺癌组织石蜡切片3 μm，二甲苯浸泡15 min，梯度乙醇由高到低（无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇）分别浸泡1min，自来水漂洗，H2O2泡10 min，自来水漂洗后浸泡于柠檬酸盐缓冲液中；4℃过夜，自来水洗，PBS洗，加一抗后4℃孵育12 h；PBS洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS洗，DAB显色4 s，自来水冲洗，苏木素复染，自来水洗，1%盐酸乙醇泡2 s，自来水洗，梯度乙醇由低到高（80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇）分别浸泡2 min，切片风干后用中性树胶封片。

Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表达等级记录：肿瘤细胞膜呈棕黄色为表达阳性（含或不含胞质染色）。Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表达及记录方法：根据肿瘤细胞阳性表达数的百分比分为0～2级。在10×10视野下连续观察整个切片，肿瘤细胞没有染色为0级，≤20%为1级，＞20%为2级。

1．4 统计分析

应用SPSS 17．0统计软件，采用单因素方差分析比较不同Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表达级别的INCTQ，如方差齐性检验显示方差不齐，则进行对数矫正，达到方差齐性后再行单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 NSCLC组织中Glut1表达

Glut1阳性表达的肿瘤细胞主要分布在坏死区周围和微血管稀少区，阳性表达率为71．2%（37／52），其中表达0、1和2级分别为15、13和24例。

2．2 NSCLC组织中碳酸酐酶Ⅸ表达

碳酸酐酶Ⅸ阳性表达的肿瘤细胞主要分布在坏死区周围，阳性表达率为48．1%（25／52），其中表达0、1和2级分别为27、12和13例。

2．3 INCTQ与Glut1表达的关系

Glut1表达0级、1级和2级者相应的INCTQ分别为0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差异有统计学意义（F＝10．633，P＝0．000），表明肺癌组织INCTQ越高，Glut1表达水平越高。见图2。

2．4 INCTQ与碳酸酐酶Ⅸ表达的关系

52例NSCLC组织中，碳酸酐酶Ⅸ表达0级、1级和2级者相应的INCTQ分别为0．69±0．77、1．10±1．27和1．34±1．18，差异无统计学意义（F＝1．980，P＝0．149），表明肺癌组织INCTQ高低与碳酸酐酶Ⅸ表达水平无明显相关性。见图3。

2．5 INCTQ与Glut1和碳酸酐酶Ⅸ共表达的关系

52例NSCLC组织中，11例Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表达均呈阴性（无表达组），20例Glut1或碳酸酐酶Ⅸ表达呈阳性（单表达组），21例Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表达均呈阳性（共表达组）。3组INCTQ分别为0．32±0．25，0．85±0．83，1．37±1．27（F＝4．449，P＝0．017），说明这两种坏死标志物不表达时，坏死不明显；共表达时，坏死程度明显。见图3。

3 讨论

坏死是恶性肿瘤的特征之一，由于恶性肿瘤生长过快，超过了其新生血管提供营养的范围，缺血区发生缺氧、坏死，如无明显液化，平扫CT则难以分辨，而早期增强CT图像则能很好地显示。因此，本课题组利用延迟35 s的CT增强图像显示来测量肺癌病灶的缺血坏死区。本课题组前期对乳腺癌的INCTQ与坏死标志物的关系进行探讨发现，CT反映的坏死程度与缺血和坏死标志物的表达有一定联系［7］，本研究进一步推广至NSCLC的研究。

用CT评价肺癌病灶的缺血坏死程度，首先要考虑到缺血坏死区与非缺血坏死区的密度差别程度，密度越低，说明缺血坏死越重；其次要考虑到缺血坏死区的面积，面积越大表明缺血坏死越重。因此，我们应用肺癌病灶的缺血坏死CT定量公式反映病灶内缺血坏死区面积和密度下降程度，较为客观全面。Ganeshan等［8］用专业组织质地分析软件检测平扫NSCLC病灶密度的混杂程度，该混杂程度反映NSCLC病灶的高细胞密度、坏死、出血以及黏液变，研究显示NSCLC组织高混杂程度与组织内Glut1表达密切相关，即反映了组织葡萄糖代谢水平的高低。

本研究结果显示，NSCLC的INCTQ与Glut 1表达相关，而与碳酸酐酶Ⅸ表达无明显相关；但与Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ共表达的关系显示，共表达组INCTQ最高，无表达组最低。由此说明，在肺癌的早期CT增强图像上测量缺血坏死程度较为准确，并且能反映NSCLC组织葡萄糖代谢水平的高低，对中晚期肺癌而言，可无创地提示个体对放化疗的敏感性程度，指导临床制定合理的综合治疗计划，提高中晚期肺癌的疗效。

［1］ Hsu PP，Sabatini DM．Cancer cell metabolism：Warburg and beyond［J］．Cell，2008，134（5）：703－707．

［2］ Mizukami Y，Kohgo Y，Chung DC．Hypoxia inducible factor-1 independent pathways in tumor angiogenesis［J］．Clin Cancer Res，2007，13（19）：5670－5674．

［3］ Weljie AM，Jirik FR．Hypoxia-induced metabolic shifts in cancer cells：moving beyond the Warburg effect［J］．Int JBiochem Cell Biol，2011，43（7）：981－989．

［4］ Airley R，Evans A，Mobasheri A，et al．Glucose transporter Glut-1 is detectable in peri-necrotic regions in many human tumor types but not normal tissues：Study using tissue microarrays［J］．Ann Anat，2010，192（3）：133－138．

［5］ 刘媛媛，曾飞球，徐平，等．肺癌组织中Glut-1蛋白的表达及其临床意义［J］．广东医学，2006，27（6）：873－874．

［6］ Loncaster JA，Harris AL，Davidson SE，et al．Carbonic anhydrase（CA IX）expression，a potential new intrinsic marker of hypoxia：correlationswith tumor oxygenmeasurements and prognosis in locally advanced carcinoma of the cervix［J］．Cancer Res，2001，61（17）：6394－6399．

［7］ Shan X，Wang D，Chen J，et al．Necrosis degree displayed in computed tomography images correlated with hypoxia and angiogenesis in breast cancer［J］．JComput Assist Tomogr，2013，37（1）：22－28．

［8］ Ganeshan B，Goh V，Mandeville HC，et al．Non-small cell lung cancer：histopathologic correlates for texture parameters at CT［J］．Radiology，2013，266（1）：326－336．

CT quantitative analysis reflects the degree of ischem ic necrosis and the level of glucosemetabolism of non-small cell lung cancer

XUWei1，SHAN Xiu-hong1，HU Hui1，CHEN Ye-rong1，CHEN Jian-hua2，DINGGuo-wen3，FAN Yu4，WANG Ya-fei1
（1．Department of Radiology，2．Department of Pathology，3．Department of Thoracic Surgery，4．Department of Oncology，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To evaluate the feasibility of CT quantitative analysis reflecting the degree of ischemic necrosis and glucosemetabolism level of non-small cell lung cancer（NSCLC）．M ethods：Fifty-two caseswith NSCLC were enrolled in the study，the ischemia necrosis CT quantitative value（INCTQ）for NSCLC tumor on early enhancement CT images before surgery weremeasured．Glucose transporter 1（Glut 1）and carbonic anhydraseⅨ（CAⅨ）protein expression with paraffin embedded specimen after operation were detected by immunohistochemical staining．Results：The INCTQ values of expression of Glut1-negative，grade 1 and grade 2 were 0．35±0．23，0．52±0．55 and 1．55±1．20，respectively（F＝10．633，P＝0．000）；the INCTQ values of the Glut1 and CA IX non-expression group，single expression group and co-expression group were 0．32±0．25，0．85±0．83 and 1．37±1．27，respectively（F＝4．449，P＝0．017）．Conclusion：The early enhancement CT could be used to appraise the ischemia necrosis degree，and reflect the level of glucosemetabolism of NSCLC．

non-small cell lung cancer；glucose transporter protein 1；carbonic anhydraseⅨ；X-ray computed tomography；ischemia necrosis

R977．3

A

1671－7783（2014）06－0470－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140137

徐炜（1982—），男，硕士研究生；单秀红（通讯作者），副教授，博士，E-mail：13913433095＠163．com

2014－04－13 ［编辑］ 刘星星