H3受体激动剂对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞趋化因子含量的影响

窦毅，杨旭东，黄秋生

（江苏大学附属医院耳鼻咽喉科，江苏镇江212001）

H3受体激动剂对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞趋化因子含量的影响

窦毅，杨旭东，黄秋生

（江苏大学附属医院耳鼻咽喉科，江苏镇江212001）

目的：探索组胺H3受体激动剂IMETIT对变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）模型豚鼠嗜酸性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞趋化因子含量的影响。方法：30只豚鼠随机均分为3组，分别为对照组、致敏组、药物处理组。对照组以生理盐水，另2组以卵清蛋白为致敏原，复制AR模型，3组均以1%卵清蛋白生理盐水溶液滴双鼻激发，记录30 min内喷嚏、挠鼻次数。AR模型建立后，对照组、致敏组、药物处理组分别以生理盐水（10 mL／kg）、生理盐水（10 mL／kg）、生理盐水（10 mL／kg）＋IMETIT（30 mg／kg）灌胃，每天1次，连续5 d，处死。取鼻中隔黏膜组织行HE染色，观察嗜酸性粒细胞浸润程度；免疫组织化学法检测嗜酸性粒细胞趋化因子含量。结果：致敏组和药物处理组30 min内喷嚏次数分别为20．90±4．88、23．10±4．59，30 min内挠鼻次数分别为26．80±4．80、25．00±3．80，均明显高于对照组（P均＝0．000）。致敏组、药物处理组每高倍视野下嗜酸性粒细胞浸润数分别为21．60±4．23、22．37±3．08，嗜酸性粒细胞趋化因子阳性表达率分别为（30．16±3．09）%、（29．60±2．88）%，两组间差异均无统计学意义（P分别为0．581和0．676）。结论：IMETIT不能减少AR模型豚鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒细胞浸润数及嗜酸性粒细胞趋化因子含量。

H3受体激动剂；变应性鼻炎；嗜酸性粒细胞；嗜酸性粒细胞趋化因子

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）即过敏性鼻炎，是机体接触变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病。嗜酸性粒细胞浸润增多是AR病理学特征之一，其参与许多病理生理过程，特别是变应性炎症反应的过程。迄今为止，嗜酸性粒细胞趋化因子eotaxin是已知的作用和选择性最强的嗜酸性粒细胞趋化有关的因子。燕志强等［1］研究发现，AR豚鼠鼻腔黏膜中嗜酸性粒细胞趋化因子的表达明显增强，而且与鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润和活化呈正相关。我们之前实验提示，H3受体激动剂IMETIT能缓解AR模型豚鼠喷嚏、流涕、挠鼻（鼻周阵发性剧烈的前爪搔抓）等典型AR症状，减轻鼻中隔黏膜病理改变，可能与豚鼠鼻黏膜P物质阳性细胞数减少、调低P物质受体mRNA表达有关［2］。为此，本实验采用卵清蛋白致敏方法制备AR模型豚鼠，观察IMETIT对其鼻中隔黏膜嗜酸性粒细胞及嗜酸性粒细胞趋化因子的影响，探讨IMETIT在AR中可能的作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组

清洁级成年豚鼠30只雌雄各半，体质量300～350 g，由江苏大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2009－0002。随机均分为对照组、致敏组和药物处理组。

1．2 试剂及药品

氢氧化铝粉（上海实验试剂公司）；IMETIT、卵清蛋白（V级）、嗜酸性粒细胞趋化因子一抗及免疫组化试剂盒［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］。

1．3 动物模型的制备及处理

［2］，致敏组、药物处理组用卵清蛋白作致敏源制备AR模型，对照组以生理盐水代替卵清蛋白作对照，3组均以1%卵清蛋白生理盐水溶液滴双鼻激发。记录30 min内各组豚鼠喷嚏、挠鼻次数。成功的AR模型能激发出喷嚏、流涕、挠鼻（鼻周阵发性剧烈的前爪搔抓）等典型AR症状。

AR模型建立成功后，对照组、致敏组、药物处理组分别以生理盐水（10 mL／kg）、生理盐水（10 mL／kg）、生理盐水（10 mL／kg）＋IMETIT（30 mg／kg）灌胃，每天1次，连续5 d。灌胃第3天药物处理组豚鼠死亡1只。3组豚鼠每天灌胃后2 h以 1%卵清蛋白生理盐水溶液鼻腔激发，于末次灌胃激发后1 h以戊巴比妥钠溶液（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，处死，取一侧鼻中隔黏膜，10%甲醛溶液固定24 h备用。

1．4 嗜酸性粒细胞浸润的观察

取已固定的鼻中隔黏膜组织做常规石蜡切片，行HE染色，光镜下观察。每张切片随机选取5个高倍视野，计算每个高倍视野下嗜酸性粒细胞浸润数，用以反映鼻中隔黏膜嗜酸性粒细胞浸润程度。

1．5 免疫组织化学法检测嗜酸性粒细胞趋化因子

切片脱蜡至水，0．01 mol／L（pH＝6．0）柠檬酸盐溶液热修复，冷却至常温；PBS洗3次，每次3 min；加3%过氧化氢，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS洗3次，每次3 min；正常血清室温封闭20 min，去除多余血清；滴加一抗（1∶100），4℃过夜；PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗，室温孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～4 min；自来水洗，苏木素复染，显微镜下观察，控制染色时间，约1 min，常规脱水封片。

阳性对照为嗜酸性粒细胞趋化因子标准品，嗜酸性粒细胞趋化因子阳性表达为胞质、胞核呈棕色，胞质内、组织间隙有棕色颗粒样物。阴性对照为未经一抗处理切片。全自动显微镜及图像分析系统（数码相机，Leica全自动显微镜，Qwin软件）随机选取3个高倍视野，计算每个高倍视野下鼻中隔黏膜中嗜酸性粒细胞趋化因子平均阳性表达率，统计结果。

1．5 统计分析

2 结果

2．1 AR模型症状

对照组、致敏组和药物处理组30 min内喷嚏次数分别为1．10±0．99、20．90±4．88、23．10±4．59（F＝89．14，P＝0．000）；致敏组、药物处理组均明显高于对照组（P均＝0．000），致敏组与药物处理组比较，差异无统计学意义（P＝0．236）。对照组、致敏组和药物处理组30 min内挠鼻次数分别为0．60± 0．69、26．80±4．80、25．00±3．80（F＝169．08，P＝0．000）；致敏组、药物处理组均明显高于对照组（P均＝0．000），致敏组与药物处理组比较，差异无统计学意义（P＝0．286）。结果表明，致敏组、药物处理组豚鼠AR模型建立成功。

2．2 IMETIT对豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润的影响

结果显示，对照组、致敏组和药物处理组每高倍视野下嗜酸性粒细胞浸润数分别为0．57±0．38、21．60±4．23、22．37±3．08（F＝164．12，P＝0．000）；致敏组与药物处理组比较，差异无统计学意义（P＝0．581）。由图1可见，对照组无明显嗜酸性粒细胞浸润，致敏组嗜酸性粒细胞浸润明显，药物处理组嗜酸性粒细胞浸润较致敏组未见明显减少。

2．3 IMETIT对鼻黏膜嗜酸性粒细胞趋化因子的影响

对照组、致敏组和药物处理组鼻中隔黏膜中嗜酸性粒细胞趋化因子阳性表达率分别为（10．50± 2．51）%、（30．16±3．09）%、（29．60±2．88）%（F＝152．80，P＝0．000）；致敏组与药物处理组比较差异无统计学意义（P＝0．676）。如图2所示，对照组嗜酸性粒细胞趋化因子阳性染色物质表达明显少，密度小；致敏组嗜酸性粒细胞阳性染色物质明显多，密度大；药物处理组嗜酸性粒细胞趋化因子阳性染色物质较致敏组未见明显减少。

3 讨论

AR属Ⅰ型变态反应，发病过程不仅有肥大细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及树突状细胞等多种细胞参与，还有多种细胞因子及炎症介质参与。AR与组胺及其受体密切相关。Nakaya等［3］发现人鼻腔黏膜表达4种组胺受体，此为H3受体激动剂对AR的作用提供了依据。IMETIT是高亲和力的H3受体激动剂［4］，故本实验中我们用IMETIT给豚鼠灌胃后观察其对AR模型豚鼠鼻黏膜中嗜酸性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞趋化因子的影响。

本实验采用卵清蛋白制作AR模型，致敏及药物处理组豚鼠均激发出典型的AR症状，表明成功复制出豚鼠AR模型。研究表明，嗜酸性粒细胞在AR患者鼻黏膜中大量聚集，在各种过敏性疾病的病理生理过程中起着重要作用［5］。Oliveira等［6］报道，呼吸道内嗜酸性粒细胞的聚集和活化程度与呼吸道变态反应性疾病的严重程度相关，并且其活化产物可活化自身及其他白细胞等，进而释放更多的细胞因子和炎症介质，从而加重炎症反应。Yokota等［7］研究发现，即使在大剂量情况下，亦未观测到H3受体激动剂——Sch 50971对AR模型小鼠鼻腔黏膜嗜酸性粒细胞的浸润产生影响，此外，体外研究发现，H3受体激动剂也不能诱导嗜酸性粒细胞趋化、变形，不能上调黏附分子［8］。本研究表明，IMETIT不能减少嗜酸性粒细胞浸润、聚集，与之相似。Nakayama等［9］还报道，人类和小鼠嗜酸性粒细胞不表达H3受体，豚鼠嗜酸性粒细胞是否也不表达有待研究。嗜酸性粒细胞趋化因子属于CC类趋化因子亚家族，目前已发现有3种亚型，分别为eotaxin-1， eotaxin-2和eotaxin-3，它们功能相似，通过与CC趋化因子受体-3结合后选择性地趋化、激活嗜酸性粒细胞［10］，促使嗜酸性粒细胞合成白三烯C4、产生活性氧簇、脱颗粒释放炎性介质等［11］，在变态反应发生过程中发挥重要作用。本实验结果显示，IMETIT灌胃后，AR模型豚鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒细胞趋化因子含量无明显降低，表明IMETIT不能抑制嗜酸性粒细胞趋化因子在黏膜中的产生、聚集，但我们前期发现经IMETIT灌胃后，AR模型豚鼠挠鼻、喷嚏次数明显减少，病理检查显示鼻中隔黏膜纤毛倒伏、紊乱、坏死、腺体增生、血管扩张及黏膜下间质水肿等病理改变明显减轻［2］，表明IMETIT不是通过减少嗜酸性粒细胞浸润、聚集及嗜酸性粒细胞趋化因子在黏膜中的产生、聚集来参与变态反应，至于具体机制，还有待进一步研究。

［参考文献］

［1］ 燕志强，章如新，余少卿，等．嗜酸细胞活化趋化因子在变应性鼻炎中的作用［J］．中国耳鼻咽喉头颈外科，2008，15（5）：262－266．

［2］ 杨旭东，孙光明，许学谷，等．组胺H3受体激动剂IMETIT对豚鼠变应性鼻炎作用的初步探讨［J］．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，24（12）：559－563．

［3］ Nakaya M，Fukushima Y，TakeuchiN，et al．Nasal allergic response mediated by histamine H3receptors in murine allergic rhinitis［J］．Laryngoscope，2005，115（10）：1778－1784．

［4］ van der Goot H，Timmerman H．Selective ligands as tools to study histamine receptors［J］．Eur JMed Chem，2000，35（1）：5－20．

［5］ Gleich GJ．Mechanisms of eosinophil-associated inflammation［J］．J Allergy Clin Immunol，2000，105（4）：651－663．

［6］ Oliveira SH，Lukacs NW．The role of chemokines and chemokine receptors in eosinophil activation during inflammatory allergic reactions［J］．Braz JMed Biol Res，2003，36（11）：1455－1463．

［7］ Yokota E，Kuyama S，Sugimoto Y，et al．Participation of histamine H3receptors in experimental allergic rhinitis of mice［J］．JPharmacol Sci，2008，108（2）：206－211．

［8］ Ling P，Ngo K，Nguyen S，et al．Histamine H4receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation［J］．Br J Pharmacol，2004，142（1）：161－171．

［9］ Nakayama T，Kato Y，Hieshima K，et al．Liver-expressed chemokine／CC chemokine ligand 16 attracts eosinophils by interacting with histamine H4receptor［J］．J Immunol，2004，173（3）：2078－2083．

［10］ Forssmann U，Uguccioni M，Loetscher P，et al．Eotaxin-2，a novel CC chemokine that is selective for the chemokine receptor CCR3，and acts like eotaxin on human eosinophil and basophil leukocytes［J］．J Exp Med，1997，185（12）：2171－2176．

［11］ Bandeira-Melo C，Herbst A，Weller PF．Eotaxins．Contributing to the diversity of eosinophil recruitment and activation［J］．Am JRespir Cell Mol Biol，2001，24（6）：653－657．

［12］ 孙光明，杨旭东，许学谷，等．组胺H3受体激动剂IMETIT对变应性鼻炎豚鼠P物质及其受体mRNA表达的影响［J］．中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，45（6）：465－470．

Effect of H3receptor agonist on eosinophils and eotaxin of allergic rhinitis in guinea pigs

DOU Yi，YANG Xu-dong，HUANG Qiu-sheng
（Department of Otorhinolaryngology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the influence of histamine receptor3（H3R）agonist，IMETIT，on eosinophils and one of eosinophilic chemokines（eotaxin）in allergic rhinitis（AR）model using guinea pigs．M ethods：Thirty guinea pigswere random ly divided into three groups：control group，sensitized group without treatment and sensitized group with drug treatment．The sensitized group with or without drug treatment were immunized by ovalbumin（OVA）to establish AR model and the control group by saline to contrast，then they were stimulated intranasal by ovalbumin（1%）respectively．The times of sneezing and scratching nose in 30min were recorded．The control group and the sensitized group without treatmentwere given gastric gavage by saline．And the sensitized group with drug treatmentwere given gastric gavage by saline（10 mL／kg）with IMETIT（30mg／kg）．Then we investigated the eosinophil infiltration degrees and eosinophilc chemokines content in nasal septum mucosa using HE staining and immunohistochemistry technology．Results：There was significant difference between the control group and the sensitized group with or without drug treatment in the numbers of sneezing and the numbers of scratching nose（P＝0．000）．There was no significant difference between the sensitized group with or without drug treatment in themeans of eosinophil and eotaxin positive expression rate in nasal septum mucosa（P＝0．581，0．676）．Conclusion：The eosinophil infiltration and the level of eotaxin of nasal septum mucous could not be reduced by histamine H3re-ceptor agonist，IMETIT．

H3receptor agonist；allergic rhinitis；eosinophil；eotaxin

R765．21

A

1671－7783（2014）06－0474－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140187

江苏大学医学临床科技发展基金资助项目（JLY20120165）

窦毅（1967—），男，江苏睢宁人，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉疾病的研究。

2014－07－02 ［编辑］ 刘星星