幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cag Q基因缺失株的构建与鉴定

姚逸正，王华，倪颖，沈以新，徐驰，孙凤英，邵世和

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cag Q基因缺失株的构建与鉴定

姚逸正，王华，倪颖，沈以新，徐驰，孙凤英，邵世和

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）Ⅳ型分泌系统cag Q基因缺失株。方法：通过PCR扩增出cag Q基因编码区侧翼同源臂序列，经TA克隆后进行双酶切，并将纯化后上下游同源臂连接至两端含有卡那霉素抗生素基因的载体pBluscriptSK II（-），构建为cag Q基因自杀质粒。利用电穿孔法将自杀质粒导入H．pylori，进行同源重组。培养后通过卡那霉素抗生素筛选出基因缺失株，并经PCR及核酸序列分析进一步确定基因缺失株。结果：H．pylori的cag Q基因自杀质粒pBlueKM40-△cag Q经酶切验证无误，进行电转化后经PCR及核酸序列分析结果正确。结论：成功获得H．pylori cag Q基因缺失株，命名为Hp26695-△cag Q。

幽门螺杆菌；Ⅳ型分泌系统；cag Q；基因缺失株

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株与质粒 H．pylori 26695、大肠埃希菌DH5α为本学院中心实验室保存；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；H．pylori自杀质粒pBlueKM40［含卡那霉素抗性基因盒的pBluescriptSK（-）载体］由韩国庆尚大学Seung-chulBaik教授馈赠。

1．1．2 实验仪器 PCR仪（Applied Biosystems公司）；化学发光凝胶成像系统（Syngene公司）；高速离心机（Eppendorf公司）；超微量分光光度仪、恒温CO2培养箱（Thermo公司）；恒温水浴箱（上海医疗器械公司）；恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司）；恒温水浴箱（上海医疗器械公司）；电击转化仪（Bio-Rad公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（南京驰顺科技有限公司）。

1．1．3 主要试剂 哥伦比亚血琼脂基础培养基、胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料生物公司；限制性核酸内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ和T4DNA连接酶购自Thermo公司；DL2000 DNA、1 kb DNA标准参照物、Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自Promeg公司；PCR扩增引物由上海英潍捷基生物工程有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 cag Q基因两侧同源臂的扩增 根据基因库中H．pylori26695基因组序列，设计引物扩增cag Q基因上下游同源臂F1、F2（表1）。图1中1～381为cag Q基因编码区，引物P1、P2用于扩增上游同源臂F1（734 bp），引物P3、P4用于扩增下游同源臂F2（803 bp）。提取H．pylori 26695基因组，进行PCR反应，反应条件为94℃5 min，94℃30 s，50℃40 s，72℃50 s，35个循环，72℃10 min。PCR扩增片段经1．5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后进行成像系统分析，然后通过胶回收试剂盒获得纯化的DNA扩增片段，于－20℃保存。

1．2．2 同源臂基因的TA克隆 将鉴定后胶回收纯化的上、下游同源臂与pMD18-T载体在T4连接酶作用下，4℃连接过夜。然后将重组质粒（F1-pMD18-T、F2-pMD18-T）转化至DH5α感受态菌体内，均匀涂布于含100μg／mL氨苄西林的固体LB营养琼脂培养基上，37℃培养约14～18 h；挑取单克隆菌落至含100μg／mL氨苄西林的液体LB培养基中，37℃200 r／min摇床内培养约12 h，抽提质粒后进行酶切鉴定。

1．2．3 pBlueKM40-△cag Q自杀质粒的构建 酶切已连接至pMD18-T载体的上、下游同源臂，胶回收。T4DNA连接酶于16℃连接同源臂与pBlueKM40，转化至DH5α感受态内，均匀涂布于含50μg／mL卡那霉素的固体LB营养琼脂培养基上，37℃温箱培养16 h；挑取单个菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，然后提取质粒，利用相应限制性内切酶进行鉴定。

1．2．4 H．pylori cag Q基因缺失株的构建与鉴定H．pylori26695菌株按照微需氧环境培养72 h，刮取哥伦比亚培养基上菌落至3 mL 10%甘油 蔗糖溶液，重悬细菌，4℃4 700 r／min离心5 min；弃上清，加8 mL 10%甘油蔗糖溶液，重悬细菌，4℃4 700 r／min离心5 min（重复2次）；将沉淀重悬于200μL 10%甘油蔗糖溶液，4℃孵育20 min，然后加入10 μg pBlueKM40-△cag Q自杀质粒并混匀，置于冰上或4℃再次孵育20 min，移入冰预冷的0．2 cm电击杯，进行电击。设定电击条件：25 F，2．5 kV，200Ω，约5 s。电击转化后迅速将全部菌液均匀涂布于含50μg／mL卡那霉素的哥伦比亚培养基上，于37℃微需氧条件下培养72 h。

收集cag Q基因缺失株，经尿素酶活性检测和革兰染色鉴定为H．pylori后，提取细菌基因组，分别以上游同源臂的引物P1和下游同源臂的引物P4作为一对引物进行PCR反应，以H．pylori 26695及双蒸水分别作为阳性、阴性对照。PCR条件：94℃5 min，94℃40 s，55℃40 s，72℃3 min，35个循环，72℃10 min。PCR扩增片段经1．5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后通过凝胶成像系统鉴定。扩增片段送上海英骏生物技术有限公司进行核酸序列分析。

2 结果

2．1 制备的cag Q基因同源臂

以H．pylori26695菌株为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示上游同源臂F1（734 bp）和下游同源臂F2（803 bp），见图2。胶回收目的片段，得到纯化的同源臂PCR产物。

2．2 成功构建同源臂F1和F2的TA克隆

将同源臂F1和F2的PCR纯化产物分别与pMD18-T载体连接，提取质粒，分别经KpnⅠ、XhoⅠ和Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切鉴定，出现上游同源臂F1（734 bp）、下游同源臂F2（803 bp），pMD18-T载体约为2 900 bp，见图3。结果表明，成功构建F1-pMD18-T、F2-pMD18-T质粒。

2．3 pBlueKM40-△cag Q自杀质粒的鉴定

构建成功的pBlueKM40-△cag Q自杀质粒经KpnⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切后，出现约734 bp片段，即为上游同源臂F1；经Eco R、Bam HⅠ限制性内切酶双酶切后，出现约803 bp片段，即为下游同源臂F2；经KpnⅠ、Bam HⅠ限制性内切酶双酶切后，出现约2 900 bp片段，即为F1＋Kmr（卡那霉素抗性基因盒）＋F2三者片段和，符合预期设计结果，见图4。

2．4 H．pylori cag Q基因缺失株的鉴定

PCR扩增结果显示，H．pylori 26695出现约1 800 bp扩增片段，缺失株则出现约2 900 bp扩增片段，阴性对照无条带，见图5。结果符合同源重组法的设计目的，且核酸序列分析结果无误，表明成功构建Hp26695-△cag Q基因缺失株。

3 讨论

H．pylori是人类常见的致病菌之一，呈全球性分布，与胃癌的发生密切相关，WHO将其列为Ⅰ类致癌原［5］。H．pylori的致病因子主要包括细胞毒素相关基因A蛋白（cytotoxin-associated gene A，CagA）、空泡细胞毒素（vaculating cytotoxin，VacA）等。而Ⅳ型分泌系统的主要功能是将CagA转运至宿主细胞，随着CagA的磷酸化，进而干扰细胞内信号传导［6－7］，诱导炎症反应及胃癌的产生［8］。然而，关于该分泌系统的研究较少，其转运机制尚未明确。

近几年来，国内外学者对H．pyloriⅣ型分泌系统的部分蛋白做了相关研究。CagW、CagT、CagV、CagX和CagY组成跨膜通道横穿细胞内外膜［9－10］；CagW有5或6个跨膜螺旋，与CagV和CagY形成内膜复合体，而CagT和CagX沿着菌毛的长度定植，CagT在菌毛的基部环形分布，对稳定其他蛋白起着重要作用；有报道称，CagT在CagA转运中起到伴侣蛋白的作用［11］；此外，对CagL、CagF等初步研究表明，CagL不仅与整合素α5β1受体相互作用［12］，也与αVβ3及αVβ5相互联系［13－14］，而且其氨基酸的多态性与胃癌有着密切联系［15］；CagF参与CagA蛋白的募集作用［16］。CagG与细菌的黏附和定植密切相关［17］；有报道指出，CagI作为Ⅳ型分泌系统重要组分［18－19］，同CagA的N端，CagY的C端，均与整合素具有相互作用［20］；CagD可能是一个多功能的Ⅳ型分泌系统蛋白［21］。Olbermann等［22］认为cag Q基因编码蛋白可能影响H．pylori的分泌，其可能与CagA蛋白相互作用，因为cag Q基因中有两条遗传谱系与CagA具有高度同源性。

因此，本研究选择cag Q基因作为研究对象，利用同源重组原理，通过PCR扩增其编码区两侧翼上、下游同源臂F1（734 bp）、F2（803 bp），然后进行TA克隆，经双酶切后与pBluscriptSKⅡ（-）自杀质粒经T4连接酶连接。将构建成功的自杀质粒通过电穿孔法导入H．pylori。培养后经过抗性筛选、PCR验证、核酸序列分析验证无误后，确定基因缺失株构建成功。目前H．pylori的Ⅳ型分泌系统中仍有很多基因编码的蛋白质（包括cag Q）功能尚不清楚，Hp26695-△cag Q基因缺失株的成功构建对于下一步深入研究cag Q在H．pylori致病机制中的作用，如对于cag A蛋白的转运，刺激靶细胞IL-8炎症因子的分泌，激活NF-κB信号通路等奠定了一定的基础。

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Construction and identification of cag Q gene-deleted mutant in typeⅣsecretion system of H．pylori

YAO Yi-zheng，WANG Hua，NIYing，SHEN Yi-xin，XU Chi，SUN Feng-ying，SHAO Shi-he
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct the cag Q gene-deleted mutant of Helicobacter pylori（H．pylori）M ethods：Polymerase chain reaction（PCR）was used to amplify the homologous gene fragments（upstream and downstream of the openreading frames）of cag Q gene．The homologous gene fragmentswere connected to pMD18-T vector and the fragmentswere cut down by restriction enzyme．Then the homologous fragments were inserted into the pBluescript SK II（-）which includes kanamycin resistance gene．The suicide plasmid pBlueKM40-△cag Q was transferred into H．p ylori through electroporation．The complete recombinant strain grown on agar plates supplemented with kanamycin was selected by PCR and confirmed through sequences analysis．Results：The suicide plasmid pBlueKM40-△cagQ was identified by restriction enzyme digestion and was transferred into H．pylori．The result of the gene-deleted mutantwas confirmed through PCR and sequencing．Conclusion：We generated the cag Q gene-deleted mutant of H．pylori（Hp26695-△cag Q）．

Helicobacter pylori；typeⅣsecretion system；cag Q；gene-deleted mutant

姚逸正（1990—），男，硕士研究生；邵世和（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：shaoshihe2006＠163．com

R378．99

A

1671－7783（2014）06－0487－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140238

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是一类微需氧、革兰染色阴性螺杆菌，主要定植于人胃黏膜表面及十二指肠球部［1］，全球感染率达50%，慢性感染常导致胃炎，甚至胃十二指肠溃疡、胃癌［2］。H．pylori中含有长度约40 kb的基因片段，即cag致病岛（cytotoxin-associated gene-pathogenicity island，cag PAI），其部分编码蛋白组成Ⅳ型分泌系统，后者由29条肽链组成［3］。然而目前对于Ⅳ型分泌系统的cag Q基因功能研究甚少，生物信息学预测其为膜相关蛋白［4］。

本文以cag PAI编码基因cag Q为研究对象，构建其基因敲除自杀质粒，获得了cag Q基因缺失株，并利用同源重组方法获得了H．pylori的cag Q基因缺失株，现报告如下。

江苏省自然科学基金青年基金资助项目（BK20130542）；江苏省科技创新与成果转化（生命健康科技）专项基金资助项目（BL2012047）；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20123227110008）

2014－09－02 ［编辑］ 刘星星