白色念珠菌生物学特性研究进展

江文俊，姜福全，崔 彦*

(1.安徽医科大学 解放军第306临床学院 普通外科,北京 100101；2.解放军第306医院 普通外科，北京 100101)

短篇综述

白色念珠菌生物学特性研究进展

江文俊1，姜福全2，崔 彦2*

(1.安徽医科大学 解放军第306临床学院 普通外科,北京 100101；2.解放军第306医院 普通外科，北京 100101)

白色念珠菌的毒力因素主要表现为对宿主细胞及组织的黏附性、菌丝的形成及分泌水解酶等三个方面。白色念珠菌的耐药机制和对周围环境的应激适应受多因素和多水平的调控，对白色念珠菌感染、耐药及应激过程中的机制尚需进一步探讨。

白色念珠菌；基本结构；基因分型；致病；耐药；应激

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一种寄生在人体皮肤黏膜的正常真菌，也是临床上重要的条件致病性菌。病原体的致病性主要取决于病原体的数量、毒力、入侵途径以及机体的抵抗能力、适应性等。白色念珠菌可引起皮肤、黏膜及内脏的念珠菌病，从而导致机体浅表或深部的白色念珠菌病乃至菌血症。随着抗真菌药物的广泛使用，随之而来的耐药菌种的大量增加，进而使白色念珠菌病的发病率不断上升，并已成为目前临床上面临的焦点问题[1-2]。本文着重从白色念珠菌的基本结构、基因分型、致病机制、对唑类药物的耐药机制及特殊环境对白色念珠菌影响等方面的研究进展作一综述。

1 白色念珠菌的基本结构及基因分型

白色念珠菌是2倍体，以3种形态并存，分别为酵母(yeast)、假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。该菌正常情况下呈圆形或卵圆形，直径3～6 μm，与机体处于共生状态，不引起疾病。机体内的这种平衡状态一旦被某些因素所破坏，白色念珠菌便出芽生成假菌丝，酵母相转变成菌丝相，大量繁殖，导致皮肤、黏膜以及全身性的真菌病[3-4]。研究证实，白色念珠菌在25S rDNA编码区内具有一可转座Ⅰ型内含子，内含子中至少含有252 bp、341 bp与379 bp 3个插入片段。设计特异性引物进行PCR扩增，并按照电泳图谱进行分型，包括A型(450 bp)、B型(840 bp)、C型(450 bp与840 bp)和D型(1080 bp)以及E型(1400 bp)。A型不具有该内含子，B型与C型均具有379 bp，A型与B型之间的有性繁殖导致C型的产生，D型具有379 bp和252 bp两类转座子，E型具有3个插入片段，分别为379 bp、252 bp和341 bp[4-5]。白色念珠菌的基本结构和基因分型虽已基本明确，但随着分子生物学技术的快速发展和研究的不断深入，有关白色念珠菌基本结构和基因分型方面必然将不断出现新认识、新观点。

2 白色念珠菌致病机制

目前认为白色念珠菌的毒力因素主要表现为3个方面：对宿主细胞及组织的黏附性、菌丝的形成及分泌水解酶。

2.1 黏附

黏附于宿主细胞表面是白色念珠菌致病过程中的首要步骤。白色念珠菌的细胞壁在细胞的黏附性、免疫修饰以及克隆的形成方面都发挥着重要作用。黏附作用主要是通过菌体表面的糖蛋白类物质与宿主细胞的糖蛋白受体相结合来完成，黏附物质包括甘露聚糖-蛋白质复合物(M-P)、甘露聚糖(Mn)、几丁质和黏附素等。白色念珠菌的黏附性包括酵母相与菌丝相的黏附，菌丝相是一种致病相，其黏附能力更强于酵母相[1,5]。

ALS基因家族是控制生物膜黏附的主要基因家族。白色念珠菌ALS基因家族包含ALS1-7及ALS9等8个成员。它们在不同条件下具有黏附作用，而且只在中期被膜中高度表达。ALS3蛋白能够调节白色念珠菌对不同宿主基质的黏附性。在体外条件下，真菌ALS3基因缺失会导致其对人类重组细胞的黏附力几乎丧失，无法生成结构完整的被膜。但在体内条件下，ALS3基因缺失几乎不影响其形成被膜的能力；或许，在体内条件下，其他黏附相关基因高度表达弥补了ALS3基因的功能。无论在体外还是体内，HWP1基因对生物膜的形成亦起重要作用。其上游BCR1基因控制HWP1、ALS1以及ALS3等基因的表达。HWP1基因的过度表达可以弥补bcr1/bcr1突变株所造成的生物膜缺陷[5-6]。

2.2 表型转换

白色念珠菌由酵母相到菌丝相的转变受到胞内外各种信号因子的调节。调控表型转换的两条主要信号传导途径分别为CAMP途径和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。孢子相真菌在环境中能够更有利的找寻新宿主并进行播散，相比之下，菌丝相则拥有更强的黏附性和入侵能力，其蛋白酶活性高，组织损伤性强。白色念珠菌侵入组织与菌丝分泌的细菌酶(可降解脂质、蛋白质和其他细胞成分)密切相关。另外，不断生成的菌丝增加了白色念珠菌抵抗吞噬细胞的能力，其可通过破坏巨噬细胞而将其杀死。因此，菌丝的生成是白色念珠菌感染发病的重要步骤[1,4]。

白色念珠菌生成菌丝体的相关基因有ALS1、ECE1、HYP1、HWP、PLC1等，ALS4基因与ALS9基因在白色念珠菌的菌相转换与体外生物膜生成中同样发挥了重要作用[5]。其他一些基因亦涉及菌丝形成的正或负向调节，这些基因的缺失株在特定培养基上促进或抑制菌落的丝状形成，如EFG1、TEC1与CPH1基因对菌丝的生长起正调控作用，其基因缺失菌株不能够形成菌丝[7]。TUP1、RFG1和NRG1编码阻遏蛋白，作用于形态转换相关基因，抑制菌丝的生成。BCR1p的靶基因包括ALS1、ALS3、HWP1和Hyr1等，BCR1基因缺失菌可以形成正常的菌丝，但是其形成的被膜厚度只占正常菌株的1/20[8]。此外，一些群体感应信号分子也在一定程度上影响着白色念珠菌形态发生变化，包括白色念珠菌分泌的法呢醇和酪醇，前者通过抑制Ras1-腺苷酸环化酶-蛋白激酶A信号通路进而抑制菌丝生长，并影响应激反应与新陈代谢以及耐药性等细胞过程，后者能够促进芽管的生成，与法呢醇在调节白色念珠菌形态方面的作用相反，其他如亚油酸的一种代谢产物3(R)-HTDE也参与群体感应，通过改变菌丝形成相关基因的表达而影响白色念珠菌的形态发生变化[9]。

2.3 分泌水解酶

白色念珠菌可产生3种最有意义的水解酶，包括分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)、磷脂酶和脂肪酶，其中Sap在白念珠菌的致病过程中起了极其重要的作用。Sap结构是一条41.5 ku的多肽，N-和C-末端残基分别是色氨酸与亮氨酸。目前研究认为，Sap是由一个包括10个基因成员的多基因家族编码的，这10个基因可分为6个家族:Sap1-3，Sap4-6，Sap7，Sap8，Sap9和Sap10。Sap酶学活性具有pH依赖性，Sap1-3、Sap4-6、Sap7与Sap8的最适宜pH值依次为3～5、5～7、6.5和2.5[1,10]。

Sap与白色念珠菌的黏附、免疫逃逸以及组织损伤等都存在直接联系。Sap的蛋白水解酶活性较高，可以水解多种宿主底物。SAP对淋巴细胞和中性粒细胞均有趋化作用，并且能够降解IgA1、IgA2和sIgA，从而使机体的免疫功能受到抑制。Sap9与初期的保护性天然免疫有关，Sap9的灭活可促使PMN反应氧中介物(reactive oxygen intermediate，ROI)减少，从而使细胞凋亡减少，而且Sap9还与中性粒细胞对白色念珠菌的识别和杀灭相关。组织损伤方面，白色念珠菌感染可诱导生成大量的细胞因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子α-TNF等，这些细胞因子能够引起组织损伤[1,3]。

Sap的菌相表达类型不尽相同。首先，Sap在酵母相和菌丝相间存在差异性表达。Sap1-3主要是在酵母相与白-灰表型转换期间表达，Sap4-6主要在酵母相向菌丝相转变时表达，而Sap7的表达与白色念珠菌的毒力无关。Sap9参与白念珠菌芽管的生成，促使中性粒细胞趋化到菌丝。再者，Sap在不同的解剖部位存在差异性表达。Sap2与Sap5分别在携带期和感染期中最常见。Sap1、Sap3、Sap4、Sap7以及Sap8表达与白色念珠菌口腔感染有关，而Sap1、Sap3以及Sap6-8表达与白色念珠菌阴道感染有关，并且Sap1、Sap3和Sap8在阴道中的白色念珠菌感染比在口腔中的白色念珠菌感染表达更加活跃。Sap9与Sap10在白色念珠菌感染患者和携带者中都存在高表达，表明这2个基因一般存在于共生和感染过程中[10-11]。

显然，白色念珠菌对宿主细胞及组织的黏附性、菌丝的形成及分泌水解酶是其主要毒力因素，但具体过程及机制尚有待深入研究，已有的部分研究结果不尽一致，亦需进一步阐明。

3 白色念珠菌对唑类药物耐药机制

白色念珠菌具有非常复杂的耐药机制，包含多因素、多水平的控制和调节。主要包括3个方面：麦角甾醇合成通路中关键靶酶的改变、编码药物外排泵的基因表达增加以及生物被膜的形成。

3.1 麦角甾醇合成通路中关键靶酶的改变

ERG11基因编码14-DM位点突变或者表达增加直接引发唑类药物和关键靶酶的亲和力下降，导致白色念珠菌耐药性的产生。研究表明，临床菌株对唑类药物的耐受还与转录因子Upc2p的A643V氨基酸置换有关[12]。通过检测白色念珠菌ERG11基因的突变位点，筛选到G464S、G307S、G448E、G450V、K143R、S405F、Y123H和R467K氨基酸位点置换促使白色念珠菌对氟康唑敏感度下降。G227D和F145I、F72S氨基酸位点置换与白色念珠菌对唑类药物的耐药高度相关[13-14]。

3.2 编码药物外排泵的基因表达增加

研究发现，易化载体超家族蛋白(major facilitator superfamily, MFS)和含ATP结合区的转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABCT)与白色念珠菌的多药耐药(multidrug resistance, MDR)密切相关。白色念珠菌MDR1受到外排泵调节因子1(regulator of effluxpump1, REP1)的负性调节作用。ABC转运蛋白的数量多达20余种，其中CDRl、CDR2表达增加导致白色念珠菌对唑类的耐药，CDR1在耐药性上发挥的作用远比CDR2重要。TAC1点突变和CDRl、CDR2的持续性高表达相关，A736V、T225A、N977D、G980E和N972D等氨基酸置换均可能引起CDR1和CDR2的高表达，从而导致耐药性的产生[15]。

3.3 生物被膜的形成

白色念株菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌均可在机体内形成生物被膜，这是该类菌产生耐药性的重要机制之一。生物膜的生成及其特性与氧化应激防御蛋白(硫氧还蛋白、烷基过氧化氢还原酶以及其过氧化物酶等)上调、神经钙蛋白信号通路改变以及部分转录因子异常表达有着密切联系。白色念株菌一旦生成生物被膜，即对抗真菌药和机体防御机能产生很强的抵抗力，病菌的黏附性和侵袭性增强，顽固而难以清除，成为造成患者死亡的主要原因之一[1,16]。研究证实，白色念株菌的生物膜相比悬浮相对抗真菌药的耐药性要高1 000多倍。目前认为，生物被膜耐药机制主要包括以下几个方面：1)细胞外基质阻碍了药物的渗入；2)生物被膜内细胞质膜脂质成分影响药物代谢；3)生物被膜内细胞生长活性下降；4)生物被膜中耐药相关基因表达；5)对抗机体的免疫防御因素和微环境发生一系列变化[16-17]。

实际上，白色念珠菌的耐药机制与其致病机制密切关联，是一个问题的两个方面。从白色念珠菌的菌丝生长和生物膜形成等生物过程暨致病机制入手，阐明其耐药机制，进而规避耐药性的产生和研发有效新药是目前面临的主要研究任务。

4 特殊环境对白色念珠菌的影响

白色念珠菌是人体内的一种条件致病菌，它可以适应各种不同的应激环境，包括离子压力、紫外线、微波、温度、氧浓度、渗透压、pH值、氧化应激损伤及抗真菌药物治疗等，机体本身包括饮食刺激、睡眠不足和劳累等因素也常为其应激条件[18]。白色念珠菌拥有多条平行的对特殊环境的应激通路，最重要者属MAPK信号传导通路，其中包括HOG通路、Cek1调节通路和Mkc1调节通路。HOG通路是渗透压改变和氧化应激等情况下的主要应激反应通路，同时参与对其他信号传导通路的调节；Cek1通过增值和菌丝生长参与菌壁的形成；Mkc1调节通路参与菌壁的完整性。氧化应激是任何菌种寄宿过程中都要面对的情况，白色念珠菌自然不会例外。研究发现，氧化应激过程中，HOG通路和Mkc1调节通路被激活，而Cek1调节通路则呈失活状态。白色念珠菌的其他应激反应机制尚包括脂质信号、Hsp和Cap1p(Candida AP-1 protein)等众多通道网络[19-21]。尽管特殊环境下的应激因子、时相、动态过程和功能应答各不相同，但对白色念珠菌的致病性及耐药性均造成重要影响[21-22]。

微重力环境也是一种特殊的应激状态。人体内部及环境中微生态的紊乱是航天飞行影响机体的最重要环节之一。研究证实，失重等太空飞行因素导致人体微生物菌落抑制、防卫菌种减少、菌群移位、菌种变异和条件致病菌种出现等，而且变异和条件致病菌种可以自动聚集，不断克隆，长时间存在，某些微生物在失重环境下会表现出对抗生素的抵抗力增强的现象[23]。有学者用回转器处理白色念珠菌SC5314，结果发现回旋器模拟微重力显著增加白色念珠菌的致病性，认为其可能是失重激活Gβ-Gα-AC-cAMP信号传导途径所致[24]。相关研究还证实，白色念珠菌处于回旋模拟微重力环境中更有利于其菌丝、菌膜的形成，促进了菌相间的转换以及耐药性的加强，并伴有表性基因表达的变化[25]。

5 展望

白色念珠菌的致病性、耐药性以及应激性机制都极其复杂，虽然近些年加强了基因克隆技术的应用与分子生物学的研究，但对白色念珠菌感染、耐药、应激过程中机制的了解还远远不够。目前，白色念珠菌感染率和对唑类药物耐药性逐年增加，而新型药物的研发较为迟缓。因此，亟需对其各方面机制进行深入研究，为白色念珠菌病的预防、早期诊断以及有效治疗奠定理论基础。

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Research progress in biological characteristics ofCandidaalbicans

JIANG Wen-jun1, JIANG Fu-quan2, CUI Yan2*

(1.Dept. of General Surgery, the 306 Clinical Hospital of Anhui Medical University, Beijing 100101; 2.Dept. of General Surgery, the 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

With the increased application of broad-spectrum antibiotics, immunosuppression, and cytotoxic therapies,Candidaalbicans, as a conditioned pathogen, has become one of the common nosocomial infection pathogen. Recent studies showed that the pathogenicity ofCandidaalbicansdepends upon hypothetical virulence factors including the adhesion to host cells, transition from yeast to mycelium, and production of secreted hydrolytic enzymes. The impacts on the evolution of drug resistance and adaptation to environmental stress rely on multiple machanisms and remain largely unexplored. Therefore, to understand the basic structure, genotype, pathogenesis, drug resistance ofCandidaalbicansand the influence of environmental stress onCandidaalbicanshas great clinical significance for disease diagnosis, treatment and prevention.

Candidaalbicans; basic structure; genotype; pathopoiesia; resistance; stress

2013-06-17

2013-10-09

全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11J051)

*通信作者(correspondingauthor)： dryancui@aliyun.com

1001-6325(2014)04-0550-05

R 756

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