12周下坡跑对去卵巢大鼠股骨骨髓脂肪组织容量和微血管密度的影响

江大雷,刘海涛

12周下坡跑对去卵巢大鼠股骨骨髓脂肪组织容量和微血管密度的影响

江大雷1，2,刘海涛1

目的：探讨运动对去卵巢大鼠骨髓脂肪组织容量及微血管密度的影响。方法：15只9周龄雌性SD大鼠随机分为3组：假手术组（SHAM）、去卵巢组（OVX）、去卵巢+运动组（OVX+EX），每组5只，OVX组和OVX+EX组行去卵巢手术，SHAM组只切除卵巢周围少量脂肪组织。OVX+EX大鼠进行12周跑台下坡跑运动，跑速为18 m/min，每天运动时间为45 min，每周5天。12周后，取右侧股骨进行骨密度测定，取左侧股骨远侧干骺端制成石蜡标本，苏木素-伊红染色（HE）用于观察骨髓病理学改变，计算骨髓脂肪组织容量百分比，采用免疫组织化学技术，CD34抗原标记血管内皮细胞，计算骨髓微血管密度（MVD）。结果：与SHAM组相比，OVX组大鼠骨密度显著下降（P<0.05），提示骨质疏松造模成功；股骨干骺端骨髓脂肪组织容量百分比显著增高（P<0.01），骨髓MVD显著降低（P<0.01）；OVX+EX组大鼠骨密度、骨髓MVD均高于OVX组（P<0.05），骨髓脂肪组织容量百分比显著低于OVX组（P<0.05）。结论：12周下坡跑运动可以有效抑制大鼠去卵巢后骨密度的下降，降低骨髓脂肪组织容量，提高骨髓微血管密度。

下坡跑；骨质疏松；骨髓微血管密度；骨髓脂肪组织

绝经后骨质疏松与骨髓间充质干细胞成脂分化增加有关，表现为骨髓脂肪细胞增多，造血组织减少，造血组织微血管密度（MVD）降低，且骨密度降低与骨髓脂肪容量增加、微血管密度下降成正相关[1]。Micro-CT观察去卵巢小鼠胫骨干骺端血管分布发现，血管容积、容积分数和平均直径均显著降低，局部血液供应显著降低[2]。抑制骨髓间充质干细胞成脂分化和改善骨组织局部血供是防治骨质疏松可能途径之一。体外研究表明[3]，力学刺激抑制骨髓间充质干细胞成脂分化和促进成骨分化；体内研究表明[4-5]，运动可以降低骨髓脂肪组织容量，但运动是否能够改善骨质疏松骨髓局部血液循环尚未见报道。本研究通过观察运动对去卵巢大鼠骨髓脂肪组织容量及MVD的影响，初步探讨运动对骨髓组织成分和血管生成的影响。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物及分组

15只9周龄SD雌性大鼠，SPF级，体重为206.8～221.9g，购于北京维通利华实验动物技术公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001，国家标准啮齿类动物饲料喂养，饲养于北京体育大学动物房，环境温度为22～24℃，相对湿度为50%～60%，灯光模拟昼夜规律，自由饮水进食。适应性喂养3天后，随机分为3组：假手术组（SHAM）、去卵巢组（OVX）和去卵巢+运动组（OVX+EX），每组5只。OVX组和OVX+EX组行去卵巢手术，而SHAM组只切除卵巢周围少量脂肪组织，连续观察大鼠3天，大鼠伤口愈合情况良好，OVX+EX组开始正式运动训练。该实验设计通过了北京体育大学实验动物伦理委员会的审查。

1.2 去卵巢手术

采用1%戊巴比妥钠0.6 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，常规备皮，在肋骨下约1.5 cm，脊柱旁开1.5 cm处切开皮肤，长度约1 cm，镊子夹持卵巢组织并提出，轻轻分离卵巢组织周围脂肪组织，组织钳夹持卵巢近端红白交接处。用手术刀片刮除卵巢组织，可吸收羊肠线结扎，碘伏涂抹创面，回纳组织入腹腔，逐层缝合后，皮肤切口处涂抹红霉素膏，并将大鼠双眼涂抹红霉素眼膏，预防感染。

1.3 动物训练方法

参考李世昌等[6]的训练方法，OVX+EX组大鼠进行跑台下坡跑运动，跑台坡度为-10°，每次运动时先进行3 min准备活动，跑速为10 m/min，之后跑速调整为18 m/min，每次训练时间为45 min，每周训练5次，共12周。

1.4 取材及处理

12周时，1%戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠后，取右侧股骨用生理盐水纱布包裹，放入-20°冰箱保存，进行骨密度测定。骨密度测定采用双能X线骨密度仪和小动物用软件测定股骨远端干骺段骨密度。取左侧股骨清理周围软组织后，截取远侧干骺端部位，经4%多聚甲醛固定24 h，转入4%EDTA溶液脱钙5周，1%草酸钠溶液进行脱钙终点检测表明脱钙完全，流水冲洗过夜，常规脱水、石蜡包埋，制作成石蜡标本。

1.5 骨髓组织病理学改变判定

参考浦权等[7]相关评定方法，石蜡标本连续切片，厚度为5 μm，取5张，进行HE染色，使用Nikon 50i显微镜光镜下观察组织病理学改变，在400×视野下，在目标区域随机选取16个视野，并记录每个视野内100个点所对应的造血组织、脂肪组织和骨小梁，如交接点对应目标组织，则计为1点，如击中边界处，则计数为1/2点，共观察1 600个点。造血或脂肪组织容量百分比为该组织击中点数占3种组织击中点数之和的比值。

1.6 免疫组化染色及微血管密度（MVD）计算方法

采用CD34抗原作为标记抗原进行血管内皮细胞，石蜡切片常规脱蜡至水，2.5%胰酶抗原修复，3%双氧水消除过氧化物酶，3%牛血清蛋白（BSA）封闭，加兔源一抗（购于武汉博士德，稀释浓度为1：100），4°过夜，次日37°复温，滴加二抗（购于武汉博士德，SP两步法超敏抗体试剂盒），室温孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。阳性切片和阴性切片对照。

微血管组织识别判断标准为棕黄色阳性的内皮细胞或内皮细胞簇，与邻近血管和骨小梁清楚分开者，不以管腔或管腔中是否有红细胞为判断标准,不计入骨小梁内或与骨小梁相连的微血管。首先在100×光镜下选取血管丰富热点区域，之后400×光镜下计数，计数5次，计算平均值，计为MVD。

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0进行统计学分析，计量资料采用Mean±SD，采用单因素方差分析比较组间差异，post hoc采用LSD检验。组间率的比较采用卡方检验，P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。

2 研究结果

2.1 大鼠体重变化

第12周时，与SHAM组（294.65±10.64）相比，OVX组（380.65±15.85）大鼠体重显著增加（P<0.01），OVX+EX组大鼠体重（340.12±12.62）显著增加（P<0.05），但OVX+EX组大鼠体重显著低于OVX组（P<0.05）。

2.2 大鼠股骨远侧干骺端骨密度的变化

与SHAM组相比，OVX组大鼠股骨远侧干骺端骨密度显著降低（P<0.05），而OVX+EX组虽低于SHAM组，但差异不显著，OVX+EX组大鼠骨密度显著高于OVX组（P<0.05）（见表1）。

表1 各组大鼠股骨干骺端骨密度（BMD）的比较Table1 Comparison on body mineral density（BMD）of femoral metaphysis among groups.

注：与SHAM组相比，#表示P<0.05；与OVX组相比，*表示P<0.05。

2.3 大鼠股骨远侧干骺端骨髓病理改变

与SHAM组相比，OVX组大鼠股骨干骺段骨髓脂肪组织容量百分比显著增高（P<0.01），骨髓造血组织容量百分比显著下降（P<0.01），骨髓MVD显著降低（P<0.01）。OVX+EX组与SHAM组相比，骨髓脂肪组织容量百分比增加（P<0.05），骨髓造血组织容量百分比减少（P<0.05），骨髓MVD无显著性差异。而OVX+ EX组大鼠骨髓脂肪组织容量百分比显著低于OVX组（P<0.05），骨髓MVD显著高于OVX组（P<0.05）（见表2、图1、图2）。

表2 各组大鼠股骨干骺段骨髓病理学指标的比较Table2 Comparison on bone marrow morphology indexes of femoral metaphysis among groups

图1 各组大鼠股骨干骺段骨髓病理学变化的比较Figure1 Comparison on bone marrow morphology of femoral metaphysis among groups

图2 各组大鼠股骨干骺端骨髓微血管密度的比较Figure2 Comparison on bone marrow MVD of femoral metaphysis

3 分析与讨论

双能X线吸收法测定骨密度是判断骨质疏松的首要标准[8]，本研究结果表明，去卵巢12周后，OVX组大鼠骨密度显著低于SHAM组，提示骨质疏松模型造模成功。而OVX+EX组大鼠进行12周的下坡跑运动后，其骨密度显著高于OVX组，这与李世昌等[6]的研究一致，证实了下坡跑运动可有效延缓去卵巢大鼠骨密度的迅速下降，具有延缓骨质疏松发生的作用。

去卵巢后大鼠体重迅速增加，OVX组大鼠体重显著高于SHAM组，并表现出体态臃肿、少动、呆滞和抑郁样表现，与去卵巢后雌激素骤然降低引起体内脂类代谢紊乱导致的脂肪堆积有关[9]。OVX+EX组大鼠体重显著低于OVX组，可能与运动可改善脂肪代谢有关。王颖捷等[9-10]证实了中等强度运动可以改善去卵巢大鼠血脂水平，降低血清TC和LDL/TC比值，降低腹腔内脂肪重量，表明运动可以改善血脂代谢紊乱状态，是防治骨质疏松的原理之一。

骨髓切片是评估骨髓组织有核细胞量或增生程度的金标准[7]，本研究结果显示，OVX组大鼠股骨干骺端脂肪组织容量百分比显著增高。基础研究表明，骨髓间充质干细胞可分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等，其中脂肪细胞和成骨细胞是“此消彼长”的关系[11]，雌激素下降可导致骨髓间充质干细胞过度分化为脂肪细胞，则导致成骨细胞数量下降，骨髓脂肪组织的增多与成骨能力的降低关系密切[12]。本研究中，OVX+EX组大鼠骨髓脂肪组织容量百分比明显低于OVX组，证实了运动可以降低骨髓脂肪细胞容量，这可能与力学刺激可以调控骨髓间充质干细胞分化有关。过氧化物酶体增殖物活化受体家族（PPARs）和骨形成因子（如Runx2）分别是在脂肪分化和成骨分化中主要的转录因子[13]，体外研究表明，力学刺激可抑制PPARγ的表达，促进RUNX2的表达，从而抑制了骨髓间充质细胞的成脂肪分化，诱导成骨分化[14]，但具体机制方面有待于进一步研究[4-5,15]。

骨髓微血管系统由毛细血管和血窦组成，完成骨髓局部物质和气体交换作用，骨微循环的变化可影响局部骨细胞代谢活动。研究结果表明，12周时，OVX组大鼠骨髓微血管密度非常显著低于SHAM组，表明去卵巢后骨髓组织局部血供能力明显下降。这与以下诸多研究一致，BURKHARDT等[16]观察骨质疏松患者活检标本骨髓脂肪细胞数量增加，而微血管减少。丁文鸽等[2]通过硅酮橡胶灌注后，显微CT观察小鼠胫骨干骺端血管分布情况，结果表明，去卵巢4周后微血管分布显著降低，局部血液供应减少。杨海涛等[17]采用动态增强MR观察去势兔椎体骨髓血流灌注情况，发现骨髓MVD显著降低，血流灌注降低，且两者显著相关，且均与BMD相关。这些研究表明，血管分布减少和血流灌注降低是骨质疏松发病的重要原因之一。而本研究中，OVX+EX组大鼠骨髓微血管密度显著高于OVX组，提示运动能够提高骨髓微血管密度，改善局部血液供应，从而实现对骨质疏松的预防作用。可能与运动抑制骨髓基质细胞的成脂肪分化，导致脂肪细胞生成减少，骨髓脂肪组织容量百分比降低有关，也可能与力学刺激促进骨髓血管生成作用有关，确切机制尚需进一步研究确定。后期的研究可采用显微CT和动态增强MRI的方法，观察微血管更多形态学指标如微血管直径等指标，以及骨髓微循环血流灌注等的变化，更为详实地描述运动对骨骼局部血液循环的影响。

4 结论

（1）大鼠去卵巢12周后，股骨干骺段骨密度降低，骨髓脂肪组织含量显著升高，骨髓微血管密度显著下降，局部组织供血能力下降，可能是骨质疏松发生机制之一。

（2）12周中等强度下坡跑运动可以有效抑制大鼠去卵巢后骨密度的下降，降低骨髓脂肪组织容量，提高骨髓微血管密度，运动可通过抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，提高骨组织局部血液供应能力，抑制骨质疏松的发展。

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Effect of 12-Week Downhill running on Femoral Bone Marrow Adipose Tissue Volume and Microvascular DensityinOvariectomizedRats

JIANG Dalei1，2，LIU Haitao1
（1.School of Graduate，Beijing Sports University，Beijing 100084，China;2.Dept.of PE，Xuchang University，Xuchang 461000，China）

Objective:To investigate the effect of exercise on bone marrow adipose tissue volume and microvascular density in ovariectomized rats.Methods:fifteen 9-week-old female SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operation group（SHAM），ovariectomized group（OVX），downhill running group（OVX+EX），5 rats in each group.The rats of OVX group and OVX+EX group underwent ovariectomy，however only a small amount of adipose tissue around the ovary was removed in SHAM group.The rats of OVX+EX group were running downhill on the treadmill for 12 weeks，the running speed was 18m/min for 45 minutes each day，5 days per week.After 12 weeks，bone mineral density（BMD）of the right femur was measured，the left distal femoral metaphysis was made into paraffin specimen which were stained with haematoxylin-eosin（HE）to observe the changes of bone marrow pathology and calculate the percentage of adipose tissue volume.The bone marrow microvascular density（MVD）was examined by means of immunohistochemical staining for CD34 to mark the vascular endothelial cell.Results:Compared with SHAM group，BMDdecreased significantly（P<0.05），which indicated the establishment of osteoporosis model，the percentage of adipose tissue volume increases significantly（P<0.01），and bone marrowMVDdecreased significantly（P<0.01）in OVX group.BMDand bone marrowMVDin the OVX+EX group were higher than that of OVX group（P<0.05），the percentage of adipose tissue volume was lower than that of OVX group（P<0.05）.Conclusions:12-week downhill running can inhibit the decline inBMDin ovariectomized rats，and reduce bone marrow adipose tissue volume and increase bone marrowMVD.

downhill running;osteoporosis;bone marrow microvascular density;bone marrow adipose tissue

G 804.5

A

1005-0000（2014）03-268-04

2014-01-11；

2014-04-27；录用日期：2014-04-28

河南省教育厅自然科学研究计划项目（项目编号：12A630130）

江大雷（1981-），男，安徽宿州人，讲师，在读博士研究生，研究方向为运动与健康、运动损伤的预防与康复。

1.北京体育大学研究生院，北京 100084；2.许昌学院体育学院，河南许昌 610041。