弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响

沈进，陈颖婷，吴亮，吴腊梅，王晓，陈盛霞，曹建平

（1．江苏大学医学院，江苏镇江212013；2．中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海200025）

弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响

沈进1，陈颖婷1，吴亮1，吴腊梅1，王晓1，陈盛霞1，曹建平2

（1．江苏大学医学院，江苏镇江212013；2．中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海200025）

目的：探讨不同数量弓形虫速殖子感染对HeLa细胞凋亡的影响。方法：24孔板培养HeLa细胞16 h，各孔接种不同数量弓形虫速殖子继续培养4 h，在培养液中加入终质量浓度为0．5μg／mL放线菌素D诱导凋亡，于加放线菌素D后8、12、24、36 h收集细胞，采用Hoechst 33258染色法和Annexin V-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果：当虫体量／细胞量（MOI）≤1时，弓形虫感染表现为抑制放线菌素D诱导的HeLa细胞凋亡；随着虫体数量增加（MOI＞1）和感染时间延长（≥24 h），虫体感染则表现为促进HeLa细胞凋亡。结论：弓形虫感染可影响体外培养的HeLa细胞的凋亡，影响程度与感染虫体数量相关。

刚地弓形虫；细胞凋亡；HeLa细胞；放线菌素D

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，几乎可感染包括人类在内的所有哺乳动物。全球近1／3人口被弓形虫感染［1］，免疫功能正常者感染后不会出现明显症状，但免疫功能降低或缺陷者感染后可引起严重的并发症。目前弓形虫病已成为器官移植和获得性免疫缺陷综合征患者死亡的主要原因之一［2］。凋亡是在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境稳定，通过基因调控使细胞自动消亡的过程，在维持组织、器官的正常形态和功能方面起着重要作用［3］。此外，凋亡还有助于宿主抵抗病原微生物的入侵，抑制病原体在细胞内增殖，保护未感染细胞并减少宿主细胞损伤，在宿主抗感染过程中发挥重要作用［4］。关于弓形虫调控宿主细胞凋亡能力的研究结果并不完全一致［5－8］。目前仍缺乏不同虫体感染量和不同感染时间条件下，虫体抑制宿主细胞凋亡能力的研究。因此，本研究探讨不同数量弓形虫对放线菌素D诱导的HeLa细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

弓形虫RH株由本室液氮冷冻保存，长期传代于人宫颈癌HeLa细胞。HeLa细胞购自中国科学院细胞库；RPMI 1640细胞培养液购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；新生牛血清和胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst 33258染色液为美国Sigma公司产品；Annexin V-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；放线菌素D为美国Sigma公司产品。

1．2 方法

1．2．1 HeLa细胞和弓形虫速殖子的培养 将He-La细胞置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液（以下简称细胞培养液），待细胞生长至完全融合，以胰酶消化液（含0．25%胰酶和0．02%EDTA）消化传代。速殖子培养时，选取生长融合至单细胞层的HeLa细胞，培养液更换为含1%胎牛血清RPMI 1640（以下简称速殖子培养液），继续培养12 h后接种适量弓形虫速殖子，4 h后换新鲜速殖子培养液继续培养至虫体涨破细胞，收集虫体用于后续实验。

1．2．2 Hoechst33258染色观察细胞凋亡率 24孔板内每孔接种1．5×105个HeLa细胞并培养16 h，按不同虫体量／细胞量（multiplicity of infection，MOI）比值（MOI分别为0．1、1、5和10）分别接种速殖子，感染后4 h更换新速殖子培养液，加入终质量浓度为0．5μg／mL的放线菌素D诱导凋亡，分别于8、12、24、36 h吸弃24孔板内旧培养液，各孔加入500μL甲醇，冰上固定5 min。弃去甲醇，PBS缓冲液洗涤2次后，各孔加入500μL Hoechst 33258工作液（5μg／mL），37℃染色15 min。弃染色液，PBS缓冲液洗涤2次后各孔加入300μL甘油，置于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并照相记录，用Image Pro软件分析凋亡率。同时设置放线菌素D诱导对照组，各组平行重复3次。

1．2．3 Annexin V-FITC／PI检测细胞凋亡率 24孔板内每孔接种1．5×105个HeLa细胞，培养16 h，感染不同数量速殖子（MOI分别为0．1、1、5和10）。感染后4 h更换新速殖子培养液，加入终质量浓度为0．5μg／mL的放线菌素D诱导凋亡，分别于8、12、24、36 h收集细胞，PBS缓冲液洗涤2次，加入500μL结合缓冲液重悬细胞，并分别加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶充分混匀，室温下避光反应15 min，通过流式细胞仪检测细胞早期凋亡率和晚期凋亡率。同时设置放线菌素D诱导对照组，各组平行重复3次。

1．3 统计学分析

2 结果

2．1 Hoechst33258法检测HeLa细胞凋亡率

不同数量速殖子感染HeLa细胞8、24、36 h时，MOI＝0．1组和MOI＝1组细胞凋亡率均小于放线菌素D诱导的对照组，但差异无统计学意义；仅在感染12 h时，细胞凋亡率明显低于对照组（P＜0．05）；随着速殖子量的增加，MOI＝5组和MOI＝10组不同时间点细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0．05），仅MOI＝5组感染12 h时的凋亡率与对照组差异无统计学意义。见图1和表1。

表1 Hoechst 33258染色法检测不同数量速殖子感染不同时间后HeLa细胞凋亡率 %±s

a：P＜0．05，与对照组比较

分组4．77±0．81 7．33±0．92 6．67±1．26 15．09±4．35 MOI＝0．1 3．34±0．61 2．81±0．49a 5．39±1．66 11．71±3．38 MOI＝1 3．67±1．14 3．06±0．29a 6．32±2．67 11．57±2．77 MOI＝5 8．15±1．74a 7．16±1．59 15．50±4．01a 21．63±5．40a MOI＝10 8．27±2．18a 9．09±1．62a 16．97±5．23a 25．92±8．72a F值8 h 12 h 24 h 36 h对照组＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 22．85 49．78 21．44 7．76 P值

2．2 Annexin V-FITC／PI法检测的细胞凋亡率

不同数量速殖子感染HeLa细胞8 h时，各感染组细胞凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；感染12、24 h时，随着速殖子量的增加和时间的延长，与对照组比较，各组细胞凋亡率先降低再增加；感染36 h时随着速殖子数量增加，细胞凋亡率逐渐降低。见图2和表2。

表2 Annexin V-FITC试剂盒法检测不同数量速殖子感染各组HeLa细胞凋亡率 %±s

a：P＜0．05，与对照组比较

8 h 12 h 24 h 36 h对照组 11．33±0．32 36．87±0．85 30．05±0．97 25．40±0．5分组7 MOI＝0．1 11．12±0．21 28．5±0．78a 40．66±6．48 22．68±0．45a MOI＝1 13．30±2．35 24．74±0．41a 45．87±5．93a 20．03±1．04a MOI＝5 14．83±2．34 37．22±0．24a 51．35±0．59a 4．85±0．66a MOI＝10 12．53±1．35 50．4±0．64a 60．32±2．47a 4．08±0．18a F值0．89 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 0．27 328．47 43．82 376．40 P值

3 讨论

弓形虫抑制被感染细胞凋亡的生物学意义在于为其自身增殖提供一个理想环境，这已成为各国研究者的共识［9］。本研究结果表明，较低数量弓形虫速殖子感染（MOI≤1）可以明显抑制HeLa细胞凋亡，但当速殖子数量较多时（MOI＞1）或感染时间超过24 h时，速殖子感染促进被感染细胞凋亡。

凋亡是细胞的基本生物学现象，在机体免疫应答中起着重要作用。众多胞内寄生病原体，如细菌［10］、病毒［11］和原虫［12］的感染都会抑制宿主细胞凋亡。这些病原体通过抑制细胞凋亡，避免被感染细胞连同病原体一并被宿主吞噬细胞清除，实现了逃避宿主细胞毒性T细胞和NK细胞介导的细胞毒作用，改变了宿主免疫进程，为病原体在宿主细胞内的生存创造了有利的环境［13－14］。

放线菌素D是一种常用的细胞凋亡诱导剂，通过嵌入DNA双螺旋的小沟中，与DNA形成复合体，导致细胞RNA聚合酶无法正常发挥功能，阻断RNA转录，同时启动细胞凋亡级联反应，从而诱导细胞凋亡的发生。本研究表明，较少量的虫体（MOI≤1）在感染早期（＜24 h）能够抑制由放线菌素D诱导的HeLa细胞凋亡，与Nash等［6］报道的弓形虫抑制由放线菌素D诱导的巨噬细胞凋亡，以及Goebel等［15］报道弓形虫抑制由放线菌素D诱导的人早幼粒白血病细胞（HL-60）凋亡的实验结果相似。

本研究分别采用了Hoechst 33258染色法和Annexin V-FITC／PI法检测细胞凋亡。其中，Hoechst 33258染色法通过凋亡小体鉴别凋亡细胞，此法需预先固定细胞，染色后需用缓冲液反复洗涤以除去多余染料，该过程可能会引起部分凋亡细胞从培养板上脱落，最终造成细胞凋亡率的偏低。同时，细胞在凋亡和有丝分裂时都会发生染色质浓缩，在荧光显微镜下呈现明亮的光点，易造成对细胞凋亡的误判［16］。Annexin V-FITC／PI法中Annexin V是一种磷脂结合蛋白，对细胞表面凋亡特异性标志物磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力，可以特异性地检测出凋亡细胞，消除了有丝分裂相细胞的干扰。该方法是收集细胞培养板内所有细胞进行检测，避免了由于染色洗涤等操作造成的细胞脱落。另外，Annexin V-FITC／PI法检测HeLa细胞凋亡时，我们发现放线菌素D处理36 h，MOI＝5和MOI＝10组的细胞凋亡率出现急剧降低。结合Annexin V-FITC／PI法中细胞PI染料检测结果，我们认为大量细胞死亡是造成细胞凋亡率急剧降低的主要原因。

研究中我们还发现，当MOI＞1或放线菌素D处理时间≥24 h时，速殖子感染细胞后表现为促进细胞凋亡。武欣等［17］研究弓形虫对MCF-7乳腺癌细胞、DU-145前列腺癌细胞、EC-109食管癌细胞和A549肺癌细胞增殖及凋亡的影响后也获得类似结果，表明弓形虫速殖子并非只是简单地抑制或促进细胞凋亡，可能是通过相当复杂的机制调控细胞的增殖和凋亡。本研究结果表明，弓形虫速殖子感染影响细胞凋亡存在着数量-效应关系和时间-效应关系，但其调控机制有待于进一步研究。

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Effect of Toxoplasma gondii tachyzoite infection on HeLa cell apoptosis

SHEN Jin1，CHEN Ying-ting1，WU Liang1，WU La-mei1，WANG Xiao1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-pin2
（1．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2．National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To explore HeLa cell apoptosiswhen infected with different number of T．gondii tachyzoites．M ethods：HeLa cells were cultured in 24-wells plates for 16 h and incubated with different number of T．gondii tachyzoites．After infected for 4 h，the concentration of0．5μg／mL actinomycin D was added into themedium．The cellswere collected in 8，12，24 and 36 h．The apoptosis of HeLa cell was determined by Hoechst33258 stain and Annexin V-FITC／PImethod．Results：When the rate of parasites／cells（multiplicity of infection，MOI）was nomore than 1（MOI≤1），the parasites could suppress the cell apoptosis．When MOI＞1 and the infection time over 24 h，the parasites could accelerate the cells apoptosis．Conclusion：T．gondii tachyzoite infection could affect the HeLa cell appotosis in vitro，and the incidence was related to the number of tachyzoites．

Toxoplasma gondii；cell apoptosis；HeLa cells；actinomycin D

R382．5

A

1671－7783（2014）05－0399－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140060

国家自然科学基金资助项目（81301453）；卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题（WSBKTKT201302）；江苏大学高级人才启动基金资助项目（13JDG023，13JDG127）；江苏省研究生创新计划资助项目（CX10B＿282Z）

沈进（1991—），男，硕士研究生；陈盛霞（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：chensxia＠ujs．edu．cn

2014－03－23 ［编辑］ 陈海林