靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

魏任雄 李克强 毛联钢 李旭军 冯伟云

●论 著

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

魏任雄 李克强 毛联钢 李旭军 冯伟云

目的 探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。 方法 构建重组慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA及重组空病毒pGCLV-GFP，分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7，获得乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。采用定量PCR法检测两组MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达，xCELLigence/RT-CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。 结果 成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1，相比MCF-7/RNAi-NC细胞组，MCF-7/RNAi-CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制，其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。 结论 乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。

乳腺癌 CDK2AP1 shRNA 细胞迁移 细胞侵袭

乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤之一，侵袭和转移是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因[1-2]。手术、化疗和放疗可以控制许多局部肿瘤，但仍无法完全根治肿瘤的转移[3]。因此，进一步探索乳腺癌发生侵袭、转移的相关机制，对于乳腺癌的临床治疗具有重要意义。细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2-associated protein 1，CDK2AP1）定位于染色体12q24.31，由115个氨基酸组成，基因全长1 627bp，主要分布于脑、肺、乳腺、肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、脊髓、前列腺、卵巢等部位[4]。CDK2AP1是CDK2基因的一个特异性负向调节蛋白，负责分解CDK2，同时能够直接与DNA聚合酶α反应，影响细胞S期DNA复制调节，从而抑制肿瘤细胞的生长[5-7]。近年有学者报道，在CDK2AP1低表达的食管癌、胃癌的患者预后较差，易发生转移[8-9]。本研究通过shRNA靶向干扰CDK2AP1，观察其对乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159购自中科院细胞所；Gibco分装RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Invitrogen公司；重组空病毒pGCLV-GFP和重组慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA病毒液购自吉凯公司；polybrene购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；细胞总RNA抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，cDNA逆转录试剂盒、SYBGreen实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；CDK2AP1及β-actin基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；Transwell小室购自美国Promega公司；鼠抗人CDK2AP1单克隆抗体及ElivisionTM试剂盒均购于基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159乳腺癌细胞系常规复苏，培养于含10%FBS的PRMI1640培养基中（加入1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素），置于含5%CO2的37℃恒温培养箱内。

1.2.2 3种乳腺癌细胞株中CDK2AP1 mRNA的表达采用定量PCR检测。3种乳腺癌细胞系用Trizol抽提细胞总RNA，用DU800型紫外分光光度计检测其浓度和纯度，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit将RNA逆转录成cDNA，然后将所得的cDNA进行定量PCR检测。根据Genebank上CDK2AP1序列设计了扩增引物，CDK2AP1-F：AAGGAGCAACCCACCAAACC；CDK2AP1-R：ATCAACTTACAATAAACGCAGAAC。看家基因β-actinDNA扩增引物，Actin-F：GGCGGCACCACCATGTACCCT；Actin-R：AGGGGCCGGACTCGTCATACT。PCR反应体系中含有SYBR Premix Ex TaqTM 5μl，上下游引物各0.4μl，模板 cDNA 1μl，ROX Reference DyeⅡ 0.2μl，ddH2O 3.0μl，共10μl。PCR反应条件：95℃45s，95℃5s，60℃35s，共38个循环。建立标准曲线，读取Ct值，△Ct=样本Ct均值-内参照Ct均值，△△Ct=△Ct-（随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参照Ct均值），目的基因mRNA的相对表达量以2-△△Ct表示。

1.2.3 重组慢病毒感染 取对数生长期的MCF-7细胞，以5×104个/孔接种到6孔板，在37℃、5%CO2培养。待细胞融合度达到30%，用polybrene（8μg/ml）预处理30min，重组慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA和pGCLV-GFP的病毒感染滴度均为3E+6（TU/ml），12h后更换新鲜PRMI 1640培养基继续培养，48h后用荧光显微镜观察感染后的两组乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的绿色荧光蛋白GFP表达情况，计算重组慢病毒转导效率。

1.2.4 重组慢病毒感染的MCF-7细胞株CDK2AP1 mRNA表达 采用定量PCR检测。按1.2.2所表述的相同方法步骤、PCR反应参数及结果分析，分别检测乳腺癌细胞MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的CDK2AP1表达情况。

1.2.5 细胞迁移能力 采用xCELLIigence/RT-CIM实时细胞电子分析系统分别检测乳腺癌细胞MCF-7/ RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1体外迁移情况。将MCF-7/pGCLV和MCF-7/RNAi-CDK2AP1细胞分别放于不含血清培养基中生长4～24h。将培养基加入至底层小室，将顶层小室置于底层小室上面，并将两者扣合在一起，以进行CIM-Plate 16的装配。在获得背景测定前，将不含血清培养基放置于顶层小室中进行水合处理，并将过滤膜放置于37℃的CO2孵育箱中1h，进行预孵育处理。于不含血清培养基中对细胞进行轻柔的胰酶消化处理，使细胞成团状，再重新悬浮细胞。对CIMPlate 16进行平衡处理后，将CIM-Plate 16放置于RTCA DP仪器工作站中，并进行背景细胞指数的测定。然后从RTCA DP仪器站中移除CIM-Plate 16，并将细胞加入至顶层中，细胞密度为理想密度。将CIM-Plate 16放置于RTCA DP仪器站中，每隔1h对细胞迁移情况进行监测，共持续65h，通过系统测量的阻抗得到细胞指数，反映迁移细胞的数量。

1.2.6 细胞侵袭能力 采用Transwell实验检测。Transwell Chamber预铺50μg/室Matrigel胶。乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1分别消化离心，重悬计数活细胞数。用无血清培养液调整细胞浓度为1×105/ml，分别取0.2ml接种于Transwell Chamber的上室，同时在Transwell Chamber下室加入含10%FBS的培养液，培养24～48h后取出，用棉签头擦去Matrigel，用PBS洗2～3次，甲醇固定后苏木精染色，在200倍光学显微镜下观察，用10%醋酸脱色，测量洗脱液OD570值。OD值与穿膜的细胞数量成正比，从而间接反映细胞的侵袭能力，实验重复3次。

2 结果

2.1 CDK2AP1在乳腺癌细胞系中的表达情况 荧光定量PCR检测结果显示，CDK2AP1 mRNA表达量由高到低依次为MCF-7＞MDA-MB-231＞SUM-159，见图1。

2.2CDK2AP1稳定干扰细胞系的建立 选取CDK2AP1高表达乳腺癌细胞系MCF-7进行重组空病毒pGCLVGFP和重组慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA感染，同一视野白光和荧光下观测MCF-7细胞，转染48h后，MCF-7细胞株空病毒pGCLV-GFP（见图2A、B）和重组慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA（见图2C、D）转导率均高于80%，绿色荧光蛋白GFP表达良好，成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。

图1 3种乳腺癌细胞系中CDK2AP1 mRNA表达量

图2 MCF-7转染48h后绿色荧光蛋白GFP的表达（A：MCF-7/ RNAi-NC细胞明场下细胞形态；B：MCF-7/RNAi-NC细胞暗场下荧光激发GFP发光情况；C：MCF-7/RNAi-CDK2AP1细胞明场下细胞形态；D：MCF-7/RNAi-CDK2AP1 GFP细胞暗场下荧光激发GFP发光情况；×100）

2.3 重组慢病毒感染的MCF-7细胞株CDK2AP1表达 通过荧光定量PCR技术检测发现，重组慢病毒对MCF-7的表达有较好的干扰抑制作用，相比MCF-7/ RNAi-NC细胞组，MCF-7/RNAi-CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显的抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 重组慢病毒感染的MCF-7细胞株CDK2AP1表达情况

2.4 抑制CDK2AP1的表达对MCF-7迁移能力的影响 检测发现，30～60h MCF-7/RNAi-NC细胞信号明显高于MCF-7/RNAi-CDK2AP1，表明MCF-7/RNAi-CDK2AP1较MCF-7/RNAi-NC细胞迁移能力明显降低，说明下调乳腺癌细胞系MCF-7 CDK2AP1的表达，其肿瘤细胞的体外细胞迁移能力明显下降，见图3。

图3 xCELLigence（RT-CIM）对乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi-NC与MCF-7/RNAi-CDK2AP1迁移运动的实时监测动态图（A：MCF-7/RNAi-NC细胞迁移情况；B：MCF-7/RNAi-CDK2AP1细胞迁移情况）

2.5 抑制CDK2AP1的表达对MCF-7侵袭能力的影响 结果显示下调乳腺癌细胞株MCF-7 CDK2AP1的表达，其肿瘤细胞的体外侵袭能力明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 MCF-7/RNAi-NC与MCF-7/RNAi-CDK2AP1乳腺癌细胞侵袭实验（A：两组细胞侵袭实验染色图，×200；B：两组相对侵袭细胞数比较）

3 讨论

乳腺癌现已成为中国女性发病率较高的恶性肿瘤之一。我国乳腺癌的发病率和病死率都呈迅猛上升态势。侵袭性与转移能力是癌细胞区别于正常细胞的最基本的特征，也是导致患者肿瘤复发，病情恶化而最终死亡的病理基础。虽然乳腺癌治疗方案不断改进，而侵袭转移仍是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因。

CDK2AP1最早从仓鼠口腔癌模型中分离[10]。CDK2AP1先前的研究主要集中在口腔、头颈肿瘤细胞增殖和细胞周期调控方面。CDK2AP1是CDK2基因的一个特异性负向调节蛋白，负责分解CDK2，同时能够直接与DNA聚合酶α反应，影响细胞S期DNA复制调节，从而抑制肿瘤细胞的生长[5-7]。有研究报道，TGF-β可激发CDK2AP1诱导肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[11]。同时当上调仓鼠颊囊癌细胞HCPC-1的CDK2AP1表达时，其诱导的EMT促进了肿瘤细胞邻近侵袭和迁移，但抑制肿瘤的远处转移[11]。另有研究报道，临床观察发现在CDK2AP1低表达的食管癌、胃癌的患者中预后较差，发生转移的情况较多[8-9]。在本研究中，通过慢病毒稳定干扰乳腺癌细胞CDK2AP1表达可显著抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。

基于本研究和相关文献报道，本研究小组推断CDK2AP1在乳腺癌转移中的可能作用及其机制为：CDK2AP1上调E-cadherin的表达，促进EMT的形成，增强乳腺癌细胞邻近侵袭和细胞迁移能力；促进CDK2的分解，降低乳腺癌在血流中的存活能力，抑制远处转移克隆的形成，以上推断尚待进一步研究进行证实。

综上所述，干扰CDK2AP1的表达可显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，预示CDK2AP1在乳腺癌的恶性进展和转移过程中发挥重要作用。本研究将为CDK2AP1作为乳腺癌的有效治疗靶点提供实验依据。

[1] Lee Y T.Breast carcinoma:pattern of metastasis at autopsy[J]. Surg.Oncol,1983,23(3):175-180.

[2] Weigelt B,Peterse J L,vant Veer L J.Breast cancer metastasis: markers and models[J].Nat Rev Cancer,2005,5(8):591-602.

[3] Steeg P S.Tumor metastasis:mechanistic insights and clinical challenges[J].Nat Med,2006,12(8):895-904.

[4]Daigo Y,SuzukiK,Maruyama O,et al.Isolation,mapping and mutation analysis ofa human cDNAhomologous to the doc-1 gene of the Chinese hamster,a candidate tumor suppressor for oral cancer[J].Genes Chromosomes Cancer,1997,20(2):204-207.

[5]ShintaniS,Ohyama H,Zhang X,et al.p12(DOC-1)is a novelcyclin-dependent kinase 2-associated protein[J].Mol Cell Biol, 2000,20(17):6300-6307.

[6] Figueiredo M L,Kim Y,St John M A,et al.p12CDK2-AP1 gene therapy strategy inhibits tumor growth in an in vivo mouse modelof head and neck cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(10):3939-3948.

[7] Figueiredo M L,Dayan S,Kim Y,et al.Expression of cell-cycle regulator CDK2-associating protein 1 (p12CDK2AP1)in transgenic mice induces testi cular and ovarian atrophy in vivo[J].Mol Reprod Dev,2006,73(8):987-997.

[8]Yoshida N,Toyama E,HayashiN,et al.p12CDK2-AP1 is associated with tumor progression and a poor prognosis in esophageal squamous cellcarcinoma[J].OncolRep,2009,22(1):35-39.

[9]ChoiMG,Sohn TS,Park S B,et al.Decreased expression ofp12 is associated with more advanced tumor invasion in human gastric cancer tissues[J].Eur Surg Res,2009,42(4):223-229.

[10] Todd R,McBride J,Tsuji T,et al.Deleted in oral cancer-1 (doc-1),a noveloraltumor suppressor gene[J].FASEB J,1995, 9(13):1362-1370.

[11] TsujiT,IbaragiS,Shima K,et al.Epithelial-mesenchymaltransition induced by growth suppressor p12CDK2-AP1 promotes tumor celllocalinvasion but suppresses distant colony growth[J]. Cancer Res,2008,68(24):10377-10386.

（本文编辑：严玮雯）

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本刊编辑部

CDK2AP1 knockdown inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cell line in vitro

WEI Renxiong,LI Keqiang, MAO Lian'gang,et al.Department of Clinical Laboratory,Ningbo Second Municipal Hospital,Ningbo 315010,China

Human breast cancerCDK2AP1 shRNA Cell Migration Cell Invasion

2014-02-17）

宁波市自然科学基金资助项目（2010A610046）

315010 宁波市第二医院检验科（魏任雄现在宁波市中医院工作），临床研究中心（李克强、毛联钢、冯伟云），乳腺外科（李旭军）

李克强，E-mail:chasejxmc@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the role of cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1(CDK2AP1)in migration and invasion of human breast cancer cells. Methods Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were constructed and transfected to human breast cancer MCF-7 cells.Migration and invasion ability of MCF-7 cells were determined with xCELLigence system and Transwell chamber assay,respectively. Results Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were transfected into MCF-7 cells successfully.After transfection, expression levels of CDK2AP1 mRNA in MCF-7 cells were reduced significantly(P＜0.05).Compared to control MCF-7/RNAi -NC cells,MCF-7/RNAi-CDK2AP1 significantly decreased the migration and invasion ability of MCF-7 cells. Conclusion Silence of CDK2AP1 significantly inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 in vitro.