长沙市野生态动物园斑马蜱pcox1基因扩增及序列分析

王喜军，堵 芳，马 君，王 挺，盛晓枫，刘 毅，刘 伟

（1.湖南省长沙市动物卫生监督所，长沙 410013；2.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

·简报·

长沙市野生态动物园斑马蜱pcox1基因扩增及序列分析

王喜军1,2，堵 芳1，马 君1，王 挺1，盛晓枫1，刘 毅1，刘 伟1

（1.湖南省长沙市动物卫生监督所，长沙 410013；2.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

为研究长沙市生态动物园引进的非洲肯尼亚斑马蜱的线粒体DNA的部分细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基（cytochrome coxidase subunit l，pcox1）基因序列的遗传变异情况，本研究对其线粒体pcox1基因序列进行PCR扩增，并使用DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67进行分析。结果显示，几种斑马蜱为消色牛蜱、丽色扇头蜱和璃眼蜱属，种间差异为0.7%～20.2%，种内相似度较高，表明pcox1基因可作为蜱种间遗传变异研究的标记，研究结果为蜱的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。

斑马；蜱；pcox1；序列分析

蜱属节肢动物门（Arthropoda）、蛛形纲（Arachnida）、蜱螨亚纲（Acari）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱总科（Ixodoidea），为专性体外吸血的节肢动物，是一类陆生脊椎动物非永久性体外寄生虫，在昆虫学、寄生虫学、医学上具有重要的地位[1]。据统计，全世界蜱总共约899种，其中约有700多种属于硬蜱科，约150种为软蜱[2]。蜱以吸食血液为生，除卵外，每个发育时期的进一步发育都必须先吸饱血[3]。蜱在自然界广泛分布于各类森林、草原、农田和灌丛，种群数量取决于宿主的数量及生态环境条件[4]。蜱是许多人畜共患疾病的病原体传播媒介和宿主。蜱所携带的病原体不仅能够传播疾病，多数情况下还能经卵遗传给后代。同时，蜱在动物界普遍寄生，经常更换宿主。因此，蜱可以在许多动物中传染疾病，并将野生动物或家畜体内的病原体经血、淋巴道传染给人类[5]。在所有能够传染疾病的媒介生物类型中，蜱传播疾病的能力仅次于蚊类[6]。

目前已报道我国的蜱可传播14种细菌、32种原虫、126种病毒、18种螺旋体、18种立克次体和一些支原体、衣原体，并分泌毒素[7]。世界上约10%的蜱携带病原体，被这种蜱叮咬后，在特定环境下将引起人、动物疾病和地方性人畜共患病（如出血热、莱姆病、无形体病、森林脑炎、蜱媒斑疹热、Q热、巴贝西虫病、猪瘟及蜱瘫等）。国内外已有几例蜱传播疾病感染导致神经损害的病例[8]。2010年我国河南省商城县爆发多起蜱叮咬人致死事件，引起人们对蜱的广泛关注，深入研究蜱的基因序列对控制和消灭蜱传播的多种疾病具有重要的意义。

线粒体DNA部分细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基（cytochrome c oxidase subunit 1，pcox1）基因是核基因组以外的线粒体基因组基因，不带重组遗传，因而每一个序列都是一个单模标本[9]。pcox1以母系遗传为主，进化速度快，无双亲遗传的遗传差异，且不受基因重组、易位等畸变影响，也无核基因中那种功能不清的片段。与核基因相比，线粒体基因的进化方式相对简捷，是研究分子进化的有价值的基因[10]。本研究通过对斑马蜱线粒体DNA pcox1进行序列分析，为种群遗传变异及进一步分子遗传学和诊断学提供参考。

1 材料与方法

1.1 虫体样品样品采自于长沙市生态动物园2010年7月从非洲肯尼亚引进的斑马（表1），各蜱样品外观形态见图1。

表1 本研究中蜱样品代码Table 1 Sample code of ticks in this study

图1 蜱样品外观形态Fig.1 The ventral and dorsal view of ticks

A: 消色牛蜱(BMP2); B: 丽色扇头蜱(BMP5); C: 丽色扇头蜱(BMP6); D: 璃眼蜱(BMP8)

A: Boophilus decoloratus (BMP2); B: Rhipicephalus pulchellu (BMP5); C: Rhipicephalus pulchellu (BMP6); D: Hyalomma(BMP8)

1.2 主要试剂WizardTM DNA Clean-Up System为Promega公司产品；Ex Taq酶、PCR试剂、DNA

Marker DL 2000为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白酶K为Merck公司产品。

1.3 方法

1.3.1 虫体DNA的提取 取灭菌且经过紫外灯照射过的眼科剪将蜱组织剪碎，加入Nucleic Lysis Solution裂解缓冲液200 μL，混匀；然后加入30 μL蛋白酶K (50 μg/μL)，对于饱血蜱虫蛋白酶K使用量加倍，可达50 μL；盖紧盖子于震荡仪上混匀， 56℃恒温培养箱中培养16～18 h，其间数次不定时的摇动，使蜱组织与裂解液、蛋白酶K充分接触并裂解。消化好的虫体悬液按Genomic DNA mini kit使用说明提取虫体DNA，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增 采用Chitimia等[11]报道的引物：pcox1F: 5′-GGAACAATATATTTAATTTTTG-3′(23bp)，pcox1R: 5′-ATCTATCCCTACTGT AAATATATG-3′（24bp）。引物由上海生工生物技术有限公司进行合成。扩增体系为25 μL：灭菌水l4.25 μL、10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgC12（25 mmol/L）4 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物（100 pmol/L）0.5 μL、下游引物（100 pmol/L）0.5 μL、Taqpolymerase（5 U/L）0.25 μL、DNA模板l μL。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；最后72℃延伸5 min。

1.3.3 pcox1序列测定及其在种系发育分析中的应用 将纯化后的PCR产物送华大基因生物有限公司测序，测序结果用DNAStar 5.0软件进行分析。从GenBankTM检索代表性的蜱pcox1序列，然后与之进行相似性比对和蜱种系发育分析，以猪蛔虫WQ为外群。利用Clustalx2.0及Phylip3.67软件对获得蜱pcox1序列进行比对及计算遗传距离。采用Mega 4.1程序中的邻接法（Neighbor-joining method，NJ）绘制系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增结果4个样品均成功地扩增出约800 bp的片段，与预期pcox1目的片段长度相符（图2）且无非特异性条带。

图2 斑马蜱pcox1基因PCR扩增结果Fig. 2 Amplifi cation of pcox1 of ticks from zebra by PCRM：DNA分子量标准（DL2000）；1～4：BMP2、BMP5、BMP6、BMP8；5：阴性对照M: DNA Marker(DL2000)；1-4: BMP2, BMP5, BMP6, BMP8; 5: Negative control

2.2 基因序列测定结果及同源分析根据测序结果，蜱pcox1序列总长为732 bp。通过DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67软件分析，各样品的pcox1种间差异明显，虽然，也存在种内差异，但大部分种内相似度很高，丽色扇头蜱BMP5与BMP6之间相似度为99%（图3）。用软件PAUP构建的MP系统进化树显示，消色牛蜱BMP2、丽色扇头蜱BMP5和BMP6、璃眼蜱BMP8的相似性高，其中BMP5与BMP6处于同一分支上，而与猪蛔虫相隔较远，这一结果与序列分析结果具有一致性（图4）。本研究首次报道了消色牛蜱和丽色扇头蜱pcox1序列。

图3 蜱pcox1基因序列差异性比较Fig. 3 Comparison of pcox1 sequence of ticks

图4 pcox1基因序列以临接法构建的进化树Fig. 4 Phylogenic tree construction based pcox1 gene using Neighbour Joining (NJ)

参考文献

[1] 杨晓军, 陈泽, 刘敬泽. 蜱类的起源和演化[J]. 昆虫知识, 2008, 45(1): 28-33.

[2] 徐广, 方庆权, Keirans J E, 等. 分子系统进化关系分析的一种新方法-贝叶斯法在硬蜱属中的应用[J]. 动物学报, 2009, 49(3): 380-388.

[3] 李鸥, 王连想, 向振强. 分子遗传标记与动物分子育种研究进展[J]. 广东农业科学, 2010, 11: 210- 212.

[4] 程天印, 周金林. 蜱源抗凝分子及其作用机制[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2004, 30(6): 583-587.

[5] 郝雪峰, 殷宏, 罗建勋. 蜱的化学和免疫学防止研究进展[J]. 动物医学进展, 2008, 29(12): 52-56.

[6] 龚海燕, 周金林, 周勇志, 等. 镰形扇头蜱—新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用[J]. 中国兽医寄生虫病, 2005, 13(3): 1-5.

[7] 宝福凯. 蜱传病原体的混合感染研究进展[J]. 中国热带医学, 2007, 7(l): 112-114.

[8] 龚海燕, 周金林. 蜱对宿主免疫调节作用的研究进展[J].动物医学进展, 2005, 26(4): 34-38.

[9] Avise J C. Moleuclar population structure and the biogeographick history of a regional founa: a case history with lessons for conservation biology[J]. Oikos, 1992, 63: 62-76.

[10] 张亚平. 从DNA序列到物种树[J]. 动物学研究, 1996, 17(3): 247-252.

[11] Chitimia L, Lin R Q, Osoroaba I, et al. Genetic characterization of ticks from southwestern Romania by sequences of mitochondrial cox1 and nad5 gene [J]. Exp Appl Acarol, 2010, 52(3): 305-311.

GENE MANIPULATION AND SEQUENCE ANALYSIS OF PCOX1 OF TICKS FROM A ZEBRA IN CHANGSHA ZOO

WANG Xi-jun1,2DU Fang1, MA Jun1, WANG Ting1, SHENG Xiao-feng1, LIU Yi1, LIU Wei1
(1. Hunan Animal Health Supervision Institute, Changsha 410013, China; 2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to illustrate sequence variation in cytochrome c oxidase subunit l (pcox1) mtDNA of ticks collected from a Kenya zebra in Changsha Ecological Zoo, pcox1 mtDNA are amplified and analyzed using softwares DNAStar (V5.01), Clustalx2.0 and Phylip3.67. The ticks collected from a zebra were Boophilus decoloratus, Rhipicephalus pulchellu and Hyalomma with inter-species difference at 0.7%-20.2%. The pcox1 gene might be used as a marker for genetic variability.

Zebra; tick; pcox1; sequence analysis

S852.746

B

：1674-6422（2014）04-0063-04

2013-06-18

湖南省教育厅一般项目（11C0669）；湖南省畜牧水产局一般项目；湖南农业大学生创新项目（DFCXY201231）；国家自然基金项目（30771616）

王喜军，女，硕士研究生，兽医学专业

刘伟，E-mail：weiliupro@163.com