云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

肖 雷，孟锦昕，李 楠，高 林，何于雯，杨 恒，胡 骑，李华春，朱建波

（云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224）

·研究论文·

云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

肖 雷，孟锦昕，李 楠，高 林，何于雯，杨 恒，胡 骑，李华春，朱建波

（云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224）

为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况，2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5～10月，每周采血1次，11～12月，每月采血1次，采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性，至11月，监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2～13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚，收获鸡胚肝脏，用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏，上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后，出现细胞病变（cytopathic effect, CPE）。采用RT-PCR方法，针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物，扩增其相应片段。结果显示，共分离到86份疑似分离物，其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增，均扩增出1156 bp片段，初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验，67份毒株为蓝舌病病毒，与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现，BTV-1株序列与同型Y863（登录号：KC879616）参考毒株的同源性为92%，BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株，分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。

蓝舌病病毒；分离；鉴定

蓝舌病（bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）通过吸血昆虫-库蠓叮咬传播，感染牛羊等反刍动物的一种非接触性传染病，全球已知至少有24个不同血清型的BTV，不同血清型对牛羊的致病性不同，且型间不能产生交叉保护。1979年张念祖等[1]在中国云南省师宗县首次发现该病并成功分离到病毒，从而证明蓝舌病在该地区的存在。为了解近年来云南师宗县蓝舌病病毒活动情况，参照澳大利亚病毒监测模式[2]，2012年在师宗县五龙乡建立了一个由10头经蓝舌病抗体检测为阴性、0.5～1岁的黄牛组成的监控群（哨兵动物），从5月至10月，每周采血1次，11月和12月各采血1次，每份样品血清经C-ELISA、AGID检测。本研究从转阳性监控动物中分离到BTV 67株，并对毒株进行中和试验鉴定血清型，明确了该地区蓝舌病流行情况及主要血清型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血样采集 10 mL真空采血管、10 mL肝素真空采血管无菌采集监控动物颈静脉血液。真空采血管血液用于分离血清，肝素真空采血管血液用于分离病毒。样品均4℃保存。

1.1.2 细胞和鸡胚 蚊子细胞（C6/36）、幼仓鼠肾细胞（BHK-21）或非洲绿猴肾细胞（Vero）由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室（以下简称本实验室）保存；10～11日龄健康鸡胚购于云南云岭广大公司。

1.1.3 血清学检测 C-ELISA、AGID试剂盒由本实验室制备；所有的抗原由本实验室保存的BTV-1型Y863毒株制备；中和试验所用的BTV 24个标准毒及24个标准阳性血清由本实验室保存和制备。

1.1.4 引物的设计与合成 对基因库提供的BTV各基因序列，通过软件分析，根据BTV较为保守的VP7基因进行序列设计引物：BTV-S7-A：5'- GTAAGT-GTA-ATC-TAA-GAG-A-3'；BTV-S7-B：5'-GTA-AGT-TTA-AAT-CGC-AAG-ACG-3'。扩增产物长度为1156 bp。引物由大连天宝生物工程公司合成。

1.1.5 参考毒株 Y863株由本实验室分离保存，血清型为BTV-1型。

1.1.6 主要试剂及器材 总RNA抽提试剂（TRizol）购自北京天根生化科技有有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plue）试剂盒、Premix Ex Taq Ver.2（loading Dye Mix）购自大连天宝生物工程公司；细胞培养瓶（板）为Costar公司产品；二氧化碳恒温培养箱（IF-151）为日本SAKURA公司产品：倒置相差显微镜倒置显微镜DMIL-Cplan为德国莱卡公司产品；PCR仪9700为美国ABI公司产品；凝胶成像系统为美国Bio-Rad产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离[2]该病毒主要存在于被感染动物的红细胞中。选用动物血清学转阳前1周的肝素抗凝血100 μL，加入到含1 mL无菌PBS（pH7.2）的1.5 mL微量离心管中，颠倒混匀，200×g 离心10 min，轻轻吸弃上清，洗涤3次。弃上清加入900 μL无菌双蒸水，涡旋混匀，确保红细胞裂解，用1 mL注射器吸取备用。选用10～11日龄健康鸡胚，在暗室内选取贴壁血管后，标记位置。用牙科电钻沿标记两侧切割，形成5 cm×10 cm的窗口，置37℃孵化箱中备用。在暗室中，进行鸡胚的静脉接种。每份样品接5枚胚，每枚胚注射0.1 mL。接种胚置35℃孵化箱中培养，逐日观察。24 h内死亡的胚，可认为是非特异性死亡，弃之；24 h后死亡的胚，4℃保存。连续观察5 d后，将活胚置4℃过夜。收集鸡胚肝脏，当1份样品中存在死、活鸡胚时，应分开收取，该工作需在BSL-2生物安全柜中进行。将收获的鸡胚用组织捣碎机捣碎，PBS悬浮，900×g离心10 min，取上清200 μL接种长成单层的C6/36细胞管（瓶）内，28℃培养箱中培养7 d，每天在倒置相差显微镜观察细胞病变（cytopathic effect, CPE）：出现CPE的细胞管（瓶）4℃保存；未出现CPE的细胞管（瓶），冻融3次后，4℃保存。将收获的C6/36细胞样品接种于长成单层的BHK-21细胞管（瓶）内，38℃培养箱中培养7 d，每天在倒置相差显微镜观察CPE：出现CPE的细胞管（瓶）4℃保存；未出现CPE的细胞管（瓶），冻融3次后，4℃保存。连续在BHK-21细胞上传3代，出现CPE的细胞管（瓶）4℃保存，扩大培养。3代都无CPE的细胞管（瓶）视为病毒分离阴性，可弃之。

1.2.2 分离病毒RNA的提取 取接毒后的单层培养细胞，按TRizol试剂盒方法抽提总RNA。提取的RNA进行RT-PCR或－80℃保存

1.2.3 病毒的RT-PCR鉴定

1.2.3.1 双链RNA变性 分别在PCR反应管加入待检和对照样品RNA各5 μL，95℃变性5 min，速取出置于冰上。

1.2.3.2 RT-PCR扩增 12.5 μL 2×1 Step Buffer (DyePlu)、1 μLPrimerScript 1 Step Enzyme Mix、0.5 μL BTV-S7-A (20 pmol/μL)、0.5 μL BTVS7-B (20 pmol/μL)、5.5 μL RNase-free H2O，加至PCR反应管中，每个管中总体积为25 μL，混匀。PCR扩增条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃再延伸5 min，4℃保持。

1.2.4 病毒血清型的鉴定 蓝舌病病毒VP2决定病毒的血清型，现至少发现24个血清型，当前还没有公认的分子学方法来定型。该病毒型与型之间不能产生或产生较低的交叉保护，中和试验作为经典的定型方法一直在使用。分离毒株在BHK-21细胞上连续传代后[4]，用24个标准阳性血清进行中和试验，且样品阳性血清用24个标准毒进行中和试验。

图1 鸡胚静脉接种及分离株静脉接种鸡胚后的病变Fig.1 Chicken embryo intravenous inoculation with erythrocyte lysis and hemorrhages of chicken embryo inoculated with isolated strain

2 结果

2.1 病毒的分离经处理的带有病毒的裂解红细胞静脉注射10～11日龄鸡胚后，鸡胚大多3～4 d出现死亡，鸡胚全身出血（图1），少部份胚末出现病理变化。鸡胚肝组织PBS悬浮、离心，上清接种C6/36细胞传1代转到BHK-21细胞盲传3代后，培养24 h后，镜下可见细胞发生融合、空泡化及呈现网状或放射状等典型的CPE（图2）；48 h可见细胞大片融合；72～96 h融合细胞死亡脱落。共分离到86份疑似分离物。根据采血时间、动物耳号依次排列命名样品，一个号码对应同时采集的一份血清及同一份肝素全血。疑似分离物的命名根据分离到该分离物肝素全血的号码命名。

图2 接种分离株96 h 后BHK-21细胞的病变（200×）Fig. 2 Cytopathic effect of BHK-21 cell at 96 h post-inoculation（200×）A: 正常培养的BHK-21细胞； B: 分离株感染后的BHK-21细胞A: Normal BHK-21 cell; B: BHK-21 cell inoculated with isolates

2.2 分离病毒株的鉴定86份疑似分离物接种在BHK-21细胞培养24 h后，出现细胞病变，48 h后CPE范围明显扩大。当70%的细胞出现CPE时，冻融3次，离心取上清，RT-PCR进行鉴定，同时设BTV-1型的Y863株为参考毒株。琼脂糖凝胶显示，67份分离株和Y863株在1156 bp位置处有光亮条带，与理论预期相符（见图3）。据此，初步确认67份分离株均为蓝舌病病毒。

图3 RT-PCR鉴定分离株Fig.3 RT-PCR result of virus isolatedM: DNA分子质量标准(DL4000); 1～16: 以引物BTV-S7-A/B扩增分离株; 17: 以引物BTV-S7-A/B扩增Y863株M: DNA Marker (DL4000); 1-16: Isolated strains (BTV-S7-A/B); 17: Y863 (BTV-S7-A/B)

2.3 分离株及对应血清的中和试验86份疑似分离物、与之对应血清用蓝舌病标准毒株、蓝舌病标准阳性血清完成了病毒中和试验、血清中和试验。结果表明，67份毒株为蓝舌病病毒，与RT-PCR结果一致。中和试验显示，67份毒株中，23株BTV-1型、5株BTV-9型、17株BTV-16型。

2.4 毒株VP2序列与分析 蓝舌病病毒的VP2基因决定病毒的血清型。为进一步鉴定中和试验结果，随机选取新分离的BTV-1型编号为120168株和BTV-16型编号为120271株进行VP2基因测序，120168株获得基因片段大小为636 bp。序列与同型Y863（KC879616）毒株进行BLAST比对，两者同源性为92%；120271株获得基因片段大小为633 bp，序列与BTV-16型登录号AB686221的毒株同源性为99%，见图4～5。RT-PCR结果与中和试验结果一致。

图4 120168株、Y863株BTV的VP2基因序列同源性分析Fig. 4 Homoloy analysis of VP2 sequence of BTV strain 120168 and Y863

图5 120271株、AB 686221株BTV的VP2基因序列同源性分析Fig.5 Homoloy analysis of VP2 sequence of BTV strain 120271 and AB686221

3 讨论

1979年张念祖等[1]在中国云南省师宗县首次发现蓝舌病并成功分离到病毒，此后湖北省（1983）、安徽省（1985）、四川省（1988）、山西省（1993）、广西壮族自治区（1985）等地均报道了该病的发现，其地理位置为北纬35度至37度以南的地区。近年来，受全球气候变化及畜产品贸易、动物流动的影响，蓝舌病在全球逐渐蔓延，呈现出向北方、高纬度蔓延的流行趋势，通过血清学检测，吉林省、辽宁省等北方省及新疆维吾尔自治区和西藏自治区海拔比较高的地区也发现该病的存在[1,6]。这些地区的环境不适合库蠓的生长和繁殖，在没有传播媒介的情况下发生蓝舌病的可能性很小，分析认为可能是通过贸易将染病的绵羊带到这些地区，也有可能是因为传播媒介库蠓适应能力逐渐增强，变异出适应高海拔及寒冷环境的品种，从而对蓝舌病进行传播，该现象与2008年在欧洲出现的情况相似[5,7]。建立监控群作为哨兵动物，对蓝舌病的预警、风险评估、流行病的研究可以起到重要作用。

本研究对蓝舌病病毒分离采用《澳大利亚动物疫病诊断技术标准》中的病毒分离方法。虽然该方法BTV分离需较长时间（35～40 d），但能获得更多的毒株。我们发现，从C6/36细胞转到BHK-21细胞传1代，往往不会出现CPE，CPE更多出现在BHK-21第2代乃至第3代。

世界卫生组织（OIE）2012修订的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中RT-PCR被列为蓝舌病病毒鉴定的国际贸易指定试验之一，采用RT-PCR可快速鉴定感染动物血液和其他组织中的BTV核酸，具有很好的特异性和灵敏性，常用作病毒的实验室鉴定。本研究通过RT-PCR检测细胞培养物中的核酸，共检测出67份核酸阳性，与病毒中和试验、血清中和试验结果一致。

师宗县是我国第一个发现蓝舌病的地区，一个工作周期（2012年的5月～12月），共分离到蓝舌病病毒67株。由于分毒工作的连续性，虽然不排除不同牛在同一时间或同一头牛在不同时间段上分离到的病毒从序列上看是同一株，但仅仅4个月的时间，组成监控群的10头监控动物蓝舌病全部转阳，说明本病在该地区广泛存在。分离株与标准阳性血清及分离株对应的样品血清与24个标准毒的中和试验表明，该地区存在有BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。本研究为进一步开展相关的病原学基础研究提供了科学依据。

[1] 张念祖, 张开礼, 李志华, 等. 绵羊蓝舌病的调查研究报告[J]. 云南畜牧兽医, 1989, (4): 3-12.

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BLUETONGUE VIRUS IN 2012 IN SHIZONG COUNTY OF YUNNAN PROVINCE

XIAO Lei, MENG Jin-xin, LI Nan, GAO Lin, HE Yu-wen, YANG Heng, HU Qi, LI Hua-chun, ZHU Jian-bo
( Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China)

The sentinel herd of 10 cattle was established in 2012 to monitor epidemiology of Bluetongue virus in Shizong county of Yunnan Province. Blood samples were taken weekly from May to October and then monthly from November to December 2014 and tested for serological response in C-ELISA and for virus isolation. The sero-conversion was revealed in August in some animals and then in November in whole sentinel herd. The erythrocyte preparations from blood samples were inoculated into chicken embryo veins. Chicken liver tissues were harvested, homogenized in PBS and centrifuged. The supernatants were inoculated into C6/36 cells and passaged in BHK-21 three times. The cytopathic effect (CPE) was observed in cell monolayers. The resulting 86 virus isolates were characterized in RT-PCR and virus neutralization (VN). The VP7 gene of Bluetongue virus was amplifi ed in conventional RT-PCR using two pairs of primers designed according to the sequences in GenBank. A 1156 bp fragment of VP7 gene was amplifi ed in RT-PCR from 67 out of 86solates. The virus neutralization was performed using 24 reference bluetongue viruses and 24 positive sera. Again, the same 67 isolates were confi rmed as Bluetongue virus. The VP2 gene of two isolates was sequenced. One isolate was determined to be BTV-1 as it shared 92% identity with the reference strain Y863 (KC879616) and another isolate was BTV-16 as it shared 99% identity with the reference strain AB686221. The VN results also had an agreement with VP2 sequencing. In conclusion, 67 isolates isolated from the sentinel herd belonged to Bluetongue virus, indicating the virus transmission among bovine herds.

Bluetongue virus ; isolation; identifi cation

S852.659.4

A

1674-6422（2014）04-0001-06

2013-11-19

云南省应用基础研究面上项目（2010ZC226）；国家公益性行业项目（农业）专项（201303035）

肖雷，男，硕士，副研究员，主要从事动物病毒学研究

朱建波，E-mail: ZhuJb@126.com