Survivin、HPV16—E7蛋白、VEGF在宫颈鳞癌及癌前病变中的表达及临床意义

汤艳

[摘要] 目的 探讨Survivin、HPV16-E7蛋白、血管内皮生长因子（VEGF）在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达及在宫颈癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组化SP法检测50例宫颈鳞癌、90例宫颈上皮内瘤变（其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各为30例）中Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF的表达，另取正常宫颈者20例为对照组。结果Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变（CINⅡ、CINⅢ）中的表达均随宫颈病变而呈递增趋势（P<0.05）；Survivin的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）；VEGF的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）；HPV16-E7蛋白的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移无关（P>0.05）。Survivin与HPV16-E7蛋白和VEGF的表达间存在正相关（r=0.417， P<0.01；r=0.378， P<0.01）。结论Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF与宫颈癌的发生、发展密切相关。

[关键词] 宫颈鳞癌；宫颈上皮内瘤变；Survivin；HPV16-E7；VEGF

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）08-0101-03

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和病死率在女性恶性肿瘤中居第二位[1]。肿瘤的发生、演变、恶化是多基因、多因素、多阶段的过程，其浸润和转移是患者死亡的主要原因。研究表明，宫颈癌的发生、发展是由于致癌因子通过不同机制致使原癌基因激活、抑癌基因失活、细胞增殖及凋亡失调所致[2]。而高危型人乳头瘤病毒（HPV）的感染在宫颈癌的发生中发挥着重要作用[3]。Survivin是一种凋亡抑制基因，该基因表达的Survivin蛋白是迄今为止发现的分子量最小也是抗凋亡作用最强的凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP）。血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的最重要的促血管生长因子，具有促进血管内皮细胞分化、增生、迁移和浸润的作用。本研究应用免疫组化SP法检测Survivin、HPV16-E7蛋白、VEGF 在宫颈鳞癌（squamors cell carcinoma of cervical，SCC）及癌前病变组织中的表达，探讨三者在宫颈癌发生、发展中的作用及相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集本院2002～2012年手术切除的140例患者石蜡包埋标本，常规取材，所有标本均经病理证实，且确诊前未接受任何治疗。患者年龄22～56岁，中位年龄41岁。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各30例。宫颈鳞癌50例：按 FIGO分期（2009年）：Ⅰb期20例、Ⅱa期30例）；按组织分化程度： 高分化22例， 中分化 12例， 低分化 16例；按有无淋巴结转移：淋巴结转移阳性者19例，淋巴结转移阴性者31例。另取同期因子宫肌瘤、子宫腺肌瘤行全子宫切除术并且术后病理证实为正常宫颈者20例作为对照组。

1.2 方法

采用SP法进行免疫组化染色。浓缩型兔抗人Survivin多克隆抗体为Neomarker公司产品，鼠抗人HPV16 -E7单克隆抗体为美国 Santa Cruz公司产品，鼠抗人VEGF单克隆抗体、SP试剂盒等均购自福州迈新生物技术开发有限公司。所有标本经10 %多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，制成4 μm厚的连续切片，根据试剂要求进行抗原热修复处理后，采用SP法进行免疫组化染色，免疫标记操作及程序见试剂说明书。取已知有该蛋白表达的切片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

以细胞质内出现棕黄色着色为Survivin 和VEGF 阳性标记。高倍镜下选取 10 个/ HPE， 每个视野计数 100 个细胞， 以每例阳性细胞数26%～50%为+， 51%～75%为+ +，≥76%为+ + +。以细胞质或细胞核呈棕黄色着色为HPV16- E7阳性标记，连续观察 10个高倍视野，以阳性细胞数 > 10%为阳性[4]。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF的表达与临床病理参数间的关系采用χ2检验，Spearman相关分析Survivin与HPV16- E7蛋白及Survivin与VEGF的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF在宫颈组织中的表达

Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、宫颈鳞癌中的表达均随宫颈病变加重而呈递增趋势。Survivin在CINⅡ组与CINⅠ组、CINⅢ组与CINⅡ组相比差异有统计学意义（χ2=4.320，P<0.05； χ2=4.444，P<0.05）、HPV16-E7蛋白CINⅡ组与CINⅠ组、CINⅢ组与CINⅡ组相比差异有统计学意义（χ2=5.079，P<0.05； χ2=4.344，P<0.05）；VEGF在CINⅡ组与CINⅠ组、CINⅢ组与CINⅡ组比较差异有统计学意义（χ2=4.812，P<0.05； χ2=4.286， P<0.05）；Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在SCC组与CINⅢ组比较差异均有统计学意义（χ2=4.391，P<0.05； χ2=3.988，P<0.05； χ2=4.688，P<0.05），见表1。

2.2宫颈鳞癌中Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF的表达与临床病理参数的关系endprint

HPV16- E7蛋白表达与临床分期、病理分级及淋巴结转移均无关（P>0.05）。Survivin的表达在中低分化者中阳性率高于高分化者（χ2=6.158，P<0.05）；Ⅱa期的阳性表达率高于Ⅰb期（χ2=4.678，P<0.05）；淋巴结转移阳性的表达率高于淋巴结转移阴性者（χ2=5.898，P<0.05）。VEGF的表达在中低分化者中阳性率高于高分化者（χ2=5.082，P<0.05）；Ⅱa期的阳性表达率高于Ⅰb期（χ2=6.527，P<0.05）；淋巴结转移阳性的表达率高于淋巴结转移阴性者（χ2=6.727，P<0.01），见表2。

2.3 各组中Survivin的表达与HPV16-E7蛋白、VEGF表达的关系

本组资料中，在CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞癌组中Survivin与HPV16- E7蛋白的阳性表达间存在正相关（r=0.417，χ2=19.125，P<0.01）；Survivin与VEGF的阳性表达间存在正相关（r=0.378， χ2=15.707，P<0.01），见表3。

3 讨论

在宫颈非典型增生向宫颈癌演变过程中，病毒整合是一重要机制。病毒的整合导致了病毒基因表达失调、宿主基因不稳定，甚至导致了细胞癌基因的激活，决定了细胞的恶性生物学行为[5]。大量流行病学和生物学资料显示，高危型HPV感染是诱发宫颈癌的重要原因。HPV的致病机制相当复杂，目前认为主要是由于HPV的E6和E7癌蛋白分别与其宿主细胞的p53和pRB蛋白结合，从而导致了p53和pRB蛋白降解和灭活，进而使上皮细胞退出分化程序，持续增生而导致肿瘤发生[6]。而HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切[7]。本研究表明，在宫颈鳞癌中HPV阳性率明显高于CIN和正常宫颈组，CINⅡ组及CINⅢ组亦高于对照组，其与宫颈癌临床分期、病理分级、淋巴结转移无关。表明HPV感染是宫颈癌发生发展的重要原因之一。因此，预防HPV感染对防止宫颈癌的发生具有重要意义。

Survivin 基因是近年来分离的凋亡抑制蛋白IPA基因家族的新成员。Survivin 的作用靶点位于凋亡途径的下游汇集点，通过死亡受体途径和线粒体途径，最终作用于Caspase-3和Caspase-7起到抗凋亡作用[8]。Survivin基因只在胚胎中表达，在成人已分化组织中不表达或低表达，但在人体内的几乎所有恶性肿瘤中都有明显表达[9]。本实验表明，Survivin在正常宫颈中低表达，在宫颈癌及其癌前病变中的表达随病情进展有逐渐增高趋势。CINⅡ组、CINⅢ组、SCC组与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）。而CINⅡ组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），提示在宫颈癌病变过程中的早期已有凋亡调节的参与。此结果与张璇等[10]的研究结果一致。

肿瘤血管生成在肿瘤组织的生长、转移中起着重要作用。VEGF是肿瘤血管生成过程中特异性最强的促血管生长因子，其在很多人类的肿瘤细胞中存在高水平的表达，且在一定程度上促进肿瘤细胞生长[11]。其与多种肿瘤的生长、转移及预后密切相关。本研究显示，从正常宫颈到CIN，再到宫颈癌，VEGF表达水平呈进行性升高，该结果与Dai[12]等结果相符。

本研究还发现，Survivin的表达和HPV16-E7蛋白的表达呈正相关（r=0417，P<0.05）。这与王江莉等[13]的研究一致。由此推测，HPV16可能直接或间接调节了Survivin蛋白的表达及细胞分布，两者对宫颈癌的发生可能起着协同作用。近年来研究证实内皮细胞中表达的VEGF能诱导和促进 Survivin 的高表达，而 Survivin 的表达上调又是内皮细胞在血管生成过程中维持生存活力的必要条件[14，15]。本实验结果亦表明，宫颈癌及癌前组织中，Survivin的表达与VEGF的表达呈正相关（r=0.378，P<0.05）。Survivin表达上调进而促进了肿瘤血管生成和浸润转移，二者在促进宫颈癌的发生发展中发挥着协同作用。

综上所述，宫颈癌中Survivin、HPV16-E7蛋白、VEGF基因表达上调，其表达与宫颈癌发生、发展密切相关。对三者进行检测，或许成为对宫颈癌患者的预后判定的重要指标[16]。

[参考文献]

[1] Sankaranarayanan R，Ferlay J. Worldwide burden of gynecological cancer：the size of the problem[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2006，20（2）：207-225.

[2] 糜若然，瞿全新. 妇科肿瘤基因诊断与治疗[M]. 北京：人民卫生出版社，2001：8，38.

[3] Huang LW，Chao SL，Chen PH，et al. Multiple HPV genotypes in cervical carcinomas improved DNA detection and typing in archival tissues[J]. J Clin Virol，2004，29（4）：271-276.

[4] Frost M，Jarboe A，Orlicky D，et al. Immunohi st ochemical loca-lization of survivin in benign cervical mucosa，cervical dysplesia，and invasive squamous cell carcinoma[J]. Am Clin Pathol，2002，117（5）：738-744.

[5] Furumoto H，Irahara M. Human papillomavirus （HPV） and cervical cancer[J]. Jmed Invest， 2002，49（3-4）：124-133.endprint

[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏荣耀，张冉冉， 孙亚娇，等. SURVIVIN基因与肿瘤相关研究进展[J]. 现代肿瘤医学，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 张璇，何爱琴，季月红. Survivin与高危型HPV的相关性及其在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌诊断预测中的意义[J]. 疑难病杂志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王晓丽，何跃东，黄娟. eIF4E和VEGF 在宫颈癌中的表达及意义[J]. 四川大学学报（医学版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陈素琴，张君娜，等. Survivin及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与人乳头瘤病毒在宫颈病变中表达的相关性[J]. 中国肿瘤临床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 鲁静，李海燕，李晓红，等. Survivin、MMP-9在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌中的表达与临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陈玉梅，金黎，陈惠琴. 不同宫颈锥切方法治疗宫颈上皮内瘤变Ⅲ级的临床疗效评价[J]. 当代医学，2012，18（19）：106-108.

（收稿日期：2013-12-19）endprint

[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏荣耀，张冉冉， 孙亚娇，等. SURVIVIN基因与肿瘤相关研究进展[J]. 现代肿瘤医学，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 张璇，何爱琴，季月红. Survivin与高危型HPV的相关性及其在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌诊断预测中的意义[J]. 疑难病杂志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王晓丽，何跃东，黄娟. eIF4E和VEGF 在宫颈癌中的表达及意义[J]. 四川大学学报（医学版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陈素琴，张君娜，等. Survivin及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与人乳头瘤病毒在宫颈病变中表达的相关性[J]. 中国肿瘤临床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 鲁静，李海燕，李晓红，等. Survivin、MMP-9在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌中的表达与临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陈玉梅，金黎，陈惠琴. 不同宫颈锥切方法治疗宫颈上皮内瘤变Ⅲ级的临床疗效评价[J]. 当代医学，2012，18（19）：106-108.

（收稿日期：2013-12-19）endprint

[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏荣耀，张冉冉， 孙亚娇，等. SURVIVIN基因与肿瘤相关研究进展[J]. 现代肿瘤医学，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 张璇，何爱琴，季月红. Survivin与高危型HPV的相关性及其在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌诊断预测中的意义[J]. 疑难病杂志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王晓丽，何跃东，黄娟. eIF4E和VEGF 在宫颈癌中的表达及意义[J]. 四川大学学报（医学版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陈素琴，张君娜，等. Survivin及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与人乳头瘤病毒在宫颈病变中表达的相关性[J]. 中国肿瘤临床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 鲁静，李海燕，李晓红，等. Survivin、MMP-9在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌中的表达与临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陈玉梅，金黎，陈惠琴. 不同宫颈锥切方法治疗宫颈上皮内瘤变Ⅲ级的临床疗效评价[J]. 当代医学，2012，18（19）：106-108.

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