兔颈动脉外膜剥离血管出血的动物模型

秦丹丹　万圣云　丁洋　詹焱青

[摘要] 目的 建立一个稳定的血管外膜剥离出血的动物模型，用于临床进一步研究局部止血药物的效果。 方法 取健康新西兰大白兔12只，随机按胶原酶浓度分为1 g/L、2 g/L、4 g/L三组，胶原酶消化兔颈动脉至动脉外膜疏松，眼科镊钝性剥离外膜，在剥离过程中出现血管渗血，观察对比不同浓度胶原酶消化后动脉出血量的变化，并取消化前后的颈动脉行HE染色，光镜下观察外膜剥离程度，以确定胶原酶最佳消化浓度及剥离程度。 结果 1g/L的胶原酶消化动脉外膜不彻底，无法造成动脉稳定的出血，4 g/L的胶原酶导致血管消化过度破裂出血，2 g/L的胶原酶消化血管外膜+眼科镊钝性剥离可使血管外膜剥离彻底，血管出血稳定。 结论 胶原酶消化+眼科镊钝性剥离血管外膜的方法可建立稳定的血管出血模型，其最佳消化浓度为2 g/L。

[关键词] 胶原酶；兔颈动脉；外膜剥离；血管出血模型

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）08-0001-03

目前临床上局部止血药物较多[1，2]，效果不一，临床上对止血药物效果的评估缺乏一种理想的出血模型，Kunio等[3]、Rall等[4]采用外科手术直接损伤动脉，导致血管破裂，出现不可控制的出血，牟华明等[5]曾采用刀片刮除的方法去除兔颈动脉外膜，但实验中发现刀片刮除外膜对血管牵张作用强，导致血管壁破裂出血，无法计量统计。本研究即尝试建立一个稳定的出血模型，用以对临床上应用的局部止血药物效果进行评估，以指导临床实践。

1 资料与方法

1.1 一般资料

健康新西兰大白兔12只，雌雄各半，体重2.5～3.0 kg（由安徽医科大学实验动物中心提供），实验动物凝血功能正常，活动不受限制，自由饮水，单笼常规喂养。试剂器材：Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），眼科镊，电子天平，石蜡切片机，材料来源、层次相同的10 mm×6 mm干纱条若干。

1.2方法

1.2.1实验分组 采用随机数字表法将实验动物分为三组：1g/L胶原酶组、2 g/L胶原酶组、4 g/L胶原酶组，每组各4只。

1.2.2动物模型建立 取3%戊巴比妥钠1 mL/kg 沿兔耳缘静脉静推麻醉动物。麻醉满意后，动物取仰卧位，头部及四肢固定于手术台上。颈前脱毛后常规碘酒、酒精消毒3遍，铺洞巾，纵行切开皮肤，逐层分离颈部筋膜及肌肉，暴露双侧颈动脉鞘，仔细游离出双侧颈动脉，长约25 mm，用长25 mm、宽15 mm的胶皮片放置于颈动脉下端，隔开颈动脉和周围组织，用干纱条迅速擦净周围渗出液，采用不同浓度Ⅱ型胶原酶浸湿的纱条外敷左侧颈总动脉，共10 min，生理盐水冲洗、中止消化，用眼科镊剥离外膜白色疏松组织，直至白色疏松组织消失。用干纱条迅速擦净周围渗出液，然后将称重好的干纱条包裹颈动脉，称重三组出血60 s的出血量，迅速用生理盐水冲洗、干纱条擦净后，再次称重三组出血60 s的出血量，反复3次，并统计出血量。另一侧颈动脉不予胶原酶消化处理，仅放置长25 mm、宽15 mm的胶皮片于颈动脉下端，迅速用干纱条擦净周围渗出液，同样方法放置干纱条称重3次出血60 s的出血量，作为阴性对照侧。

1.2.3取材及固定 称重结束后立即取出双侧颈动脉，标本截取3段，迅速浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h以上，石蜡包埋固定切片。

1.3组织形态学观察

标本石蜡包埋后切片，切片按常规进行HE染色，高倍显微镜下观察外膜剥离效果及内膜的病理变化。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料（60 s组织出血量）用（x±s）表示，1 g/L浓度的胶原酶实验侧与阴性对照侧、2 g/L浓度的胶原酶实验侧与阴性对照侧间60 s组织出血量的比较均采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血管外膜成功剥离

正常兔颈动脉结构分为内膜、中膜及外膜，见图1A。2 g/L胶原酶消化+眼科镊剥离可达到外膜基本剥离的效果。HE染色下可见血管外膜结缔组织基本剥离，平滑肌层暴露于最外层，见图1B。而1 g/L组血管外膜剥离不彻底HE染色下可见仍残留部分结缔组织，见图1 C；4 g/L组血管外膜剥离完全，血管破裂，无法取材。

2.2 眼科镊刮剥血管外膜至血管广泛出血

正常兔颈动脉外膜组织学结构主要包括外弹力层、滋养血管、神经末梢及周围疏松结缔组织，如图2所示。经胶原酶消化后，血管外膜结缔组织明显疏松，易用眼科镊锐性剥离外膜结缔组织，在刮剥的过程中，因外膜结缔组织消失，使外膜滋养血管广泛暴露损伤，最终血管出血，见图3。

2.3不同浓度胶原酶对血管外膜消化程度影响

1g/L的胶原酶消化动脉外膜不彻底，无法造成动脉稳定出血，1 g/L实验侧60 s出血量与阴性对照侧比较，差异无统计学意义（P>0.05），考虑为组织损伤后炎性渗出。2 g/L实验侧胶原酶消化+钝性剥离血管外膜造成的出血稳定，血管外膜基本剥离，见图1B，未予任何处理后，出血不能自止，该组实验侧出血量明显高于阴性对照侧，差异有统计学意义（P<0.05）。4 g/L组实验组60 s出血量大，出血量已超过纱条吸附液体量，无法进行定量统计，且实验动物迅速死亡。见表1。

3 讨论

外科手术中，术中出血不可避免，然而减少出血量，缩短手术时间，对手术预后有重要影响，而局部止血药的应用在其中起重要作用。目前局部止血药物种类繁多，缺乏一种理想的局部出血模型来评价局部止血药物的效果。

相关文献[5-8]报道，动脉壁是一个有序的层状结构，分为内膜、中膜及外膜。外膜组织学结构主要包括外弹力层、滋养血管、神经末梢及周围疏松结缔组织。血管结缔组织内包括胶原、弹性蛋白和多种组织细胞（巨噬细胞、成纤维细胞等）。血管外膜具有丰富的滋养血管，主要存在于大动脉的外膜，起营养血管外膜的作用。血管外膜的滋养血管分为外部滋养血管、内部滋养血管以及静脉滋养血管。血管外膜主要构成了血管的支撑结构和提供滋养血管的作用，全程参与了血管损伤与修复的全过程。

Kunio等[3]、Rall等[4]采用单纯的外科手术锐性损伤血管导致血管出血。该手术方法难度较大，由于器械直接损伤血管全层，操作过程中易导致动脉瘤形成、血管直接破裂，出现不可控制出血。国内牟华明等[5]也曾尝试采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜对血管牵张作用强，易刮伤血管壁造成机械损伤、出血。在预实验的过程中，研究发现器械直接锐性刮剥血管易导致血管破裂、出血迅速、出血量大、无法定量测定、实验动物迅速死亡。

汤月霞等[9]、胡远程等[10]采用胶原酶消化血管外膜方法，发现胶原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜变为白色，HE染色下发现外膜较消化前明显疏松，容易用器械钝性剥离。剥离至外膜白色疏松组织消失的程度，HE染色下发现外膜基本剥离干净。

本实验采用胶原酶消化+眼科镊剥离血管外膜方法，使血管结构破坏，导致血管出血。考虑到实验的操作性、实验数据的量化，我们选取了供血丰富、分支较少、位置相对表浅易暴露的兔颈动脉，在预实验过程中发现兔颈动脉较腹主动脉、股动脉等大动脉便于操作，暴露充分，对周围组织影响小，出血量可达满意效果。

1g/L浓度组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧相差不大，通过HE染色发现，血管外膜仍残留部分结缔组织，外膜滋养血管未裸露，提示1g/L浓度胶原酶消化血管外膜不彻底，经眼科镊钝性剥离后，血管无明显出血。2 g/L胶原酶组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧有显著差异，HE染色发现，血管外膜结缔组织剥离彻底，外膜滋养血管广泛裸露，内膜及中膜无破坏，提示2 g/L胶原酶消化外膜彻底，经眼科镊钝性剥离后，外膜滋养血管广泛出血，出血量稳定，且有统计学意义。4 g/L浓度组60 s出血量已超过纱条吸附液体量，且血管破裂，实验动物迅速死亡，提示4 g/L胶原酶消化外膜过度。

综上所述，2 g/L胶原酶消化+眼科镊钝性剥离血管外膜可导致外膜滋养血管广泛破坏，而血管中膜及内膜结构未破坏，出血量及出血速度稳定，实验操作可重复性及操作性好，因此可以成为一种评估局部止血药物效果的稳定、理想的出血模型。

[参考文献]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用单纯的外科手术锐性损伤血管导致血管出血。该手术方法难度较大，由于器械直接损伤血管全层，操作过程中易导致动脉瘤形成、血管直接破裂，出现不可控制出血。国内牟华明等[5]也曾尝试采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜对血管牵张作用强，易刮伤血管壁造成机械损伤、出血。在预实验的过程中，研究发现器械直接锐性刮剥血管易导致血管破裂、出血迅速、出血量大、无法定量测定、实验动物迅速死亡。

汤月霞等[9]、胡远程等[10]采用胶原酶消化血管外膜方法，发现胶原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜变为白色，HE染色下发现外膜较消化前明显疏松，容易用器械钝性剥离。剥离至外膜白色疏松组织消失的程度，HE染色下发现外膜基本剥离干净。

本实验采用胶原酶消化+眼科镊剥离血管外膜方法，使血管结构破坏，导致血管出血。考虑到实验的操作性、实验数据的量化，我们选取了供血丰富、分支较少、位置相对表浅易暴露的兔颈动脉，在预实验过程中发现兔颈动脉较腹主动脉、股动脉等大动脉便于操作，暴露充分，对周围组织影响小，出血量可达满意效果。

1g/L浓度组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧相差不大，通过HE染色发现，血管外膜仍残留部分结缔组织，外膜滋养血管未裸露，提示1g/L浓度胶原酶消化血管外膜不彻底，经眼科镊钝性剥离后，血管无明显出血。2 g/L胶原酶组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧有显著差异，HE染色发现，血管外膜结缔组织剥离彻底，外膜滋养血管广泛裸露，内膜及中膜无破坏，提示2 g/L胶原酶消化外膜彻底，经眼科镊钝性剥离后，外膜滋养血管广泛出血，出血量稳定，且有统计学意义。4 g/L浓度组60 s出血量已超过纱条吸附液体量，且血管破裂，实验动物迅速死亡，提示4 g/L胶原酶消化外膜过度。

综上所述，2 g/L胶原酶消化+眼科镊钝性剥离血管外膜可导致外膜滋养血管广泛破坏，而血管中膜及内膜结构未破坏，出血量及出血速度稳定，实验操作可重复性及操作性好，因此可以成为一种评估局部止血药物效果的稳定、理想的出血模型。

[参考文献]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用单纯的外科手术锐性损伤血管导致血管出血。该手术方法难度较大，由于器械直接损伤血管全层，操作过程中易导致动脉瘤形成、血管直接破裂，出现不可控制出血。国内牟华明等[5]也曾尝试采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜对血管牵张作用强，易刮伤血管壁造成机械损伤、出血。在预实验的过程中，研究发现器械直接锐性刮剥血管易导致血管破裂、出血迅速、出血量大、无法定量测定、实验动物迅速死亡。

汤月霞等[9]、胡远程等[10]采用胶原酶消化血管外膜方法，发现胶原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜变为白色，HE染色下发现外膜较消化前明显疏松，容易用器械钝性剥离。剥离至外膜白色疏松组织消失的程度，HE染色下发现外膜基本剥离干净。

本实验采用胶原酶消化+眼科镊剥离血管外膜方法，使血管结构破坏，导致血管出血。考虑到实验的操作性、实验数据的量化，我们选取了供血丰富、分支较少、位置相对表浅易暴露的兔颈动脉，在预实验过程中发现兔颈动脉较腹主动脉、股动脉等大动脉便于操作，暴露充分，对周围组织影响小，出血量可达满意效果。

1g/L浓度组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧相差不大，通过HE染色发现，血管外膜仍残留部分结缔组织，外膜滋养血管未裸露，提示1g/L浓度胶原酶消化血管外膜不彻底，经眼科镊钝性剥离后，血管无明显出血。2 g/L胶原酶组实验侧60 s渗出量与阴性对照侧有显著差异，HE染色发现，血管外膜结缔组织剥离彻底，外膜滋养血管广泛裸露，内膜及中膜无破坏，提示2 g/L胶原酶消化外膜彻底，经眼科镊钝性剥离后，外膜滋养血管广泛出血，出血量稳定，且有统计学意义。4 g/L浓度组60 s出血量已超过纱条吸附液体量，且血管破裂，实验动物迅速死亡，提示4 g/L胶原酶消化外膜过度。

综上所述，2 g/L胶原酶消化+眼科镊钝性剥离血管外膜可导致外膜滋养血管广泛破坏，而血管中膜及内膜结构未破坏，出血量及出血速度稳定，实验操作可重复性及操作性好，因此可以成为一种评估局部止血药物效果的稳定、理想的出血模型。

[参考文献]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.