黑龙江省大豆镰孢根腐病菌鉴定及致病力分析

张 丽， 耿肖兵， 王春玲， 李永刚*

（1.东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.黑龙江省高校寒地作物品种改良与生理生态重点开放实验室，哈尔滨 150030）

黑龙江省大豆镰孢根腐病菌鉴定及致病力分析

张 丽1，2， 耿肖兵1，2， 王春玲1，2， 李永刚1，2*

（1.东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.黑龙江省高校寒地作物品种改良与生理生态重点开放实验室，哈尔滨 150030）

摘要对黑龙江省不同区域采集的大豆根腐病病原种类进行鉴定，结果表明：分离的296个真菌分离物分属于10个种，分别为尖镰孢（Fusarium oxysporum）、茄镰孢（F.solani）、木贼镰孢（F.equiseti）、轮枝镰孢（F.verticillioides）、半裸镰孢（F.semitectum）、大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）、瓜果腐霉（Pythium aphanidematum）、茄丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷镰孢（F.graminearum）、厚垣镰孢（F.chlamydosporum），各分离物分离频率分别为68.24%、7.09%、5.41%、4.05%、3.38%、3.38%、3.04%、2.70%、2.03%和0.68%。利用‘合丰25’测定所有镰孢菌分离物的致病力，病情指数在30以上的分离物占镰孢菌总数的23.42%，其中尖镰孢为18.22%。在中等以上（病情指数＞30）致病力镰孢菌分离物中，尖镰孢占77.78%。黑龙江省不同地理区域均有致病力较强的分离物，分布不均匀。大豆花芽分化期分离的致病力较强，尖镰孢出现频率比鼓粒期大。本研究为大豆根腐病的田间防治和抗源筛选的研究奠定了基础。

关键词大豆； 根腐病； 病原菌； 尖镰孢； 致病力

大豆镰孢根腐病是影响我国大豆单产最严重的威胁之一，一般使大豆减产10%～30%，重病地区可减产60%，甚至绝产［1］。种植大豆年限愈久的地块发病愈重，产量越低。大豆根腐病主要危害植株根系，从而影响根系对水分和养分的吸收，造成植株生长缓慢，产量降低［2］。

引起大豆根腐病的病原菌有多种真菌，但主要致病菌的种类变化不大。王晓艳等［3］2011年在东北三省大豆主产区分离到8种镰孢菌对大豆均有致病力，其中尖镰孢（Fusarium oxysporum Schl.）有强致病力；茄镰孢［F.solani（Mart.）Sacc.］、禾谷镰孢（F.graminearum Schw.）、半裸镰孢（F.semitectum Berk.＆Ravenel）、燕麦镰孢［F.avenaceum（Fr.）Sacc.］、木贼镰孢［F.equiseti（Corda）Sacc.］和厚垣镰孢［F.chlamydosporum（Corda）Sacc.］均为中等致病力，轮枝镰孢［F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg］为弱致病力。邢安2009年从黑龙江不同地区通过形态学鉴定出8种镰孢菌，它们是尖镰孢、木贼镰孢、茄镰孢、半裸镰孢、轮枝镰孢、燕麦镰孢、禾谷镰孢及蓝色镰孢（F.coeruleum Lib.ex Sacc.），其中尖镰孢和茄镰孢的分离频率最高［4］。白丽艳等自新疆阿勒泰地区采集分离的镰孢菌属菌株分别为尖镰孢、茄腐镰孢、禾谷镰孢、茄镰孢蓝色变种、燕麦镰孢和节状镰孢。其中，对‘黑河5号’致病力测定中尖镰孢为大豆镰孢根腐病病原菌中出现频率最高且致病力最强的优势致病种，茄镰孢次之［5］。马淑梅2012年从黑龙江省大豆产区100个地点采集根腐病株，分离镰孢菌42.7%，腐霉菌25.2%，立枯丝核菌7%，疫霉菌25.2%［6］。总体上，镰孢菌在所有分离物中分离的频率最高。

目前的研究报道均认为尖镰孢是大豆根腐病的优势致病种，其引起的根腐病是大豆苗期的一种常发性土传病害，危害较重，根治困难［7-8］。明确大豆根腐病致病菌种类和分布对病害防治时期和用药种类十分重要，而解决该病危害最经济有效的措施是种植抗病品种，选择具有代表性的分离物进行抗源筛选是防治的前提和基础［6］。因此，全面开展黑龙江省大豆根腐病病原种类、分布调查及致病力分析等工作具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

真菌分离与纯化：本试验于2011年6月和9月从哈尔滨、佳木斯、齐齐哈尔及黑河地区等采集大豆根腐病花芽分化期病株和鼓粒期病株。采用常规组织分离法分离真菌。将病害标样，用自来水反复冲洗，每病株取病健交界处的组织1块，75%的乙醇消毒2 s，然后用0.1%升汞液消毒3 min，灭菌水洗3～4次后，移植于平板培养基上，置于26℃恒温箱中培养，48 h后纯化，不同分离物转移至带PDA培养基的试管中4℃保存备用。

供试品种：大豆品种‘合丰25’由大豆生物学教育部重点实验室提供。

1.2 分离物鉴定及致病力测定

1.2.1 形态学鉴定

挑取纯化后的分离物，转移至PDA培养基上，26℃培养箱中黑暗培养4 d后，进行鉴定。如是镰孢菌则接种至PDA和SNA两种培养基，参照文献［4］对分离物进行形态学鉴定；大豆拟茎点种腐病菌参照文献［9］，立枯丝核菌参照文献［10］，腐霉菌参照文献［11］进行形态学鉴定。

1.2.2 镰孢菌致病力测定

将所有的镰孢菌分离物分别在PDA平板上培养4 d，打取直径7 mm的菌碟接种到高粱粒培养基中，每个三角瓶（每250 m L三角瓶装1／5高粱粒）中接种5个菌碟，26℃培养箱中培养，期间每天振荡三角瓶1次，待菌丝布满每一个高粱粒表面即可用于接种，大约需要5 d左右。将无菌蛭石装入8 cm培养钵中，约为容量的1／3，每钵约10粒带菌高粱粒，覆上0.2 cm无菌蛭石，播种经10%次氯酸钠消毒处理的大豆品种（‘合丰25’），每钵10粒种子，再在种子表面覆盖2 cm无菌干蛭石，放入不锈钢盘中，以未接种分离物的植株作对照，每个处理3次重复，试验重复2次。浇足水后放在25℃光暗交替各12 h条件下培养，正常管理，10 d后调查结果。

病情分级参照白丽艳等［5］提出的标准略有改进，将根腐病严重度划分为5个级别。

0级：无病；

1级：须根根尖轻微变黑，主根不变，植株生长正常；

3级：须根根尖变黑，主根轻微变黑严重，植株生长正常；

5级：主根变黑严重，地上部生长不良，或下胚轴腐烂，植株生长矮小；

7级：根部腐烂，植株死亡。

大豆镰孢根腐病菌对大豆品种（‘合丰25’）的致病力评价，病情指数≤30为弱致病力；30＜病情指数≤70为中等致病力；病情指数＞70为强致病力。

1.2.3 接种发病后的再分离

凡致病力测定中对照不发病，而接种植株有发病的，采用组织分离法再次分离发病组织，获得与第一次从田间病株相同形态的分离物，确定这些分离物为大豆根腐病的致病菌。

2 结果与分析

2.1 不同地理区域大豆根腐病菌鉴定

在大豆的花芽分化期和鼓粒期采集田间根腐病株600株，采用组织分离法分离病原菌，进行柯赫氏法则验证。通过形态学鉴定，确定296个分离物为致病菌，结果如表1所示。

296个分离物分属于10个种，镰孢菌占分离大豆根腐病病原菌总数的90.88%。尖镰孢占病原菌总数的68.24%，茄镰孢占7.09%，木贼镰孢占5.41%，轮枝镰孢占4.05%，大豆拟茎点种腐病菌占3.38%，瓜果腐霉占3.04%，立枯丝核菌占2.70%。上述结果表明，黑龙江省大豆根腐病田间优势菌株为尖镰孢。从幼苗根部分离到大豆拟茎点种腐病菌，所占比率为3.38%，是今后黑龙江省大豆生产上需要重点关注的病害之一。

表1 黑龙江省大豆根腐病株真菌分离物的种类鉴定Table 1 Identification of fungal isolates causing soybean root rot in Heilongjiang Province

2.2 大豆镰孢根腐病菌的致病力测定

上述结果表明，大豆根腐病菌中镰孢菌出现频率最高。因此，本试验选取镰孢菌分离物进行致病力的分析，结果如表2所示。

表2 大豆镰孢根腐病菌分离物致病力的测定Table 2 Virulence of Fusarium spp.causing soybean root rot

从表中可以看出，尖镰孢占镰孢菌总数的75.09%，其他镰孢菌出现频率均小于8%，本研究所采集的地理区域中田间优势菌株为尖镰孢。从致病力范围来看，致病力较强的菌株主要出现在尖镰孢、茄镰孢和木贼镰孢，其他镰孢菌致病力相对较弱。

黑龙江省不同地理区域均有致病力较强的分离物，病情指数在30以上的镰孢菌占镰孢菌总数的23.42%，其中尖镰孢占18.22%、茄镰孢占1.86%、轮枝镰孢占1.49%、木贼镰孢占1.12%和半裸镰孢占0.74%，而未发现禾谷镰孢和厚垣镰孢的中等以上致病力的分离物。尖镰孢在中等（病情指数＞30）致病力以上的镰孢菌分离物中占77.78%，在大豆根腐病菌中所占比例最大。

依据黑龙江省地理区域划分对尖镰孢的致病力分布进行分析，哈尔滨和齐齐哈尔市的致病力较强分离物出现频率大，分别占36.51%和23.81%，而黑河地区、佳木斯和鸡西地区出现频率较小，分别占17.46%、15.87%和6.35%。

将不同地理区域采集的分离物按采集时大豆的生育期进行分析，病情指数达到30以上的尖镰孢分离物，68.25%分离自大豆花芽分化期病株，而来自鼓粒期的分离物所占比例为31.75%，表明从花芽分化期发病植株所分离出来致力较强尖镰孢出现频率大于成株。

3 讨论

土传病害的病原菌种类及数量因受到气候因子、多种土壤类型演替和生物因子等因素影响，其变化较快［13］。王晓艳等［3］2011年研究认为黑龙江省大豆镰孢根腐病的致病菌为尖镰孢、茄镰孢、禾谷镰孢、半裸镰孢、燕麦镰孢、木贼镰孢、厚垣镰孢和轮枝镰孢8种镰孢菌，而本研究中发现了其中7种镰孢菌，未发现燕麦镰孢。与邢安等［4］2009年报道的结果相比，增加了厚垣镰孢，而没有蓝色镰孢和燕麦镰孢。马淑梅［6］2012年研究黑龙江省大豆根腐病菌种类发现，镰孢菌占42.7%，腐霉菌为25.2%，立枯丝核菌为7%，疫霉菌为25.2%。不同研究所获得的数据存在较大差异，主要和研究目的、采样时间、地点和样品量、分离方法、培养基种类及分离的目标菌有关。

大豆尖镰孢为田间优势种得到众多研究者公认。但是，本研究结果比以往研究［3-6］中尖镰孢出现频率更大且毒力更强，镰孢菌占分离的病原菌总数的90.88%，尖镰孢占病原菌总数的68.24%。分析原因是本研究分离物每病株仅分离1块组织，且均为病健交界明显的部位，而王晓艳和邢安则是1株病株分离多块组织；同时，也与采集的时期、地点、接种方法及接种体的数量存在较大关系，最终导致分离的不同镰孢菌出现频率差别较大和较多的毒力强的菌株。而且，在本研究中从大豆幼苗根腐病株根部首次分离到大豆拟茎点种腐病菌（P.longicolla），所占比率为3.16%，该菌能引起大豆成株期茎枯病，是一种对大豆危害极为严重的病害［9］，在大豆生产过程中是值得关注和深入研究的。本研究认为目前大豆根腐病的防治和抗病育种重点工作仍需放在尖镰孢上，这是大豆根腐病今后一段时间内研究的重点。

从分离地理区域来看，不同地理区域所分离到的分离物致病力存在差别，哈尔滨和齐齐哈尔市采集的尖镰孢致病力强的分离物出现频率较大。经初步分析，认为哈尔滨和齐齐哈尔地区和采集的大豆病株多为大面积种植的地块，重迎茬相对严重，而黑河、鸡西和佳木斯地区采集病株的地域相对种植面积较小，重迎茬较少。总体上说来，不同地理区域均有存在致病力强的分离物，但致病力强的分离物分离频率存在差异。

从花芽分化期和鼓粒期大豆根腐病株所分离的尖镰孢致病力分析，来自花芽分化期分离出来的尖镰孢致病力强的分离物出现频率较大。分析原因所在，尖镰孢一般在温度较低时（苗期）引起较严重的大豆根腐病，后期对大豆的影响较小，后期所分离的尖镰孢有可能以腐生或弱寄生的较多。鉴于此，本研究认为对于大豆尖镰孢抗源的筛选，以苗期鉴定为主是科学准确的，其结果可代表大多数品种对尖镰孢的抗性表现。

参考文献

［1］ 梁喜龙，郑殿峰，左豫虎.大豆根腐病的研究现状及展望［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2003，15（4）：30-34.

［2］ 白雪梅，唐忠信.大豆根腐病的致病因子及发病规律［J］.大豆通报，1997（3）：13.

［3］ 王晓艳，文景芝.东北三省大豆根腐镰孢菌种类及其致病力分析［J］.中国油料作物学报，2011，33（4）：391-395.

［4］ 邢安，文景芝，吕国忠，等.黑龙江省大豆根腐病株上镰孢菌的分离与鉴定［J］.东北农业大学学报，2009，40（8）：5-9.

［5］ 白丽艳，张全党，李斌，等.新疆阿勒泰地区大豆镰刀菌根腐病病原鉴定及致病力测定［J］.新疆农业科学，2009，46（3）：543-548.

［6］ 马淑梅.黑龙江省大豆根腐病致病病原种类分布及抗病种质鉴定［J］.中国农学通报，2012，28（27）：230-235.

［7］ 李保英，马淑梅.大豆根腐病原菌种类及抗源筛选［J］.植物保护学报，2000，27（1）：91-93.

［8］ 马汇泉，辛惠普.大豆根腐病病原菌种类鉴定及其生物学研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，1988（2）：115-121.

［9］ 崔友林，段灿星，丁俊杰，等.一种新发生的大豆茎枯病病原菌鉴定［J］.中国油料作物学报，2010，32（1）：99-103.

［10］周黎，李国英，丁建.新疆加工番茄根腐病病原的分离和鉴定［J］.新疆农业科学，2008，45（1）：130-134.

［11］赵思峰，王钦英，李晖，等.新疆甜菜湿腐型根腐病病原的鉴定［J］.石河子大学学报（自然科学版），2002，6（4）：289-291.

［12］Qaher A M.Biodiversity of the genus Fusarium in saline soil habitats［J］.Journal of Basic Microbiology，2006，46（6）：480-494.

中图分类号：S 435.29

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.031

收稿日期：2013-05-30

修订日期：2013-06-27

基金项目：东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室（SB12B01）；黑龙江省高校寒地作物品种改良与生理生态重点开放实验室开放基金

*通信作者E-mail：neaulyg＠126.com

Identification and virulence of Fusarium spp.causing soybean root rot in Jeilongjiang Province

Zhang Li1，2， Geng Xiaobing1，2， Wang Chunling1，2， Li Yonggang1，2
（1.Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Key Laboratory of Physiology，Ecology and Genetic Improvement of Cold Crops of Higher Education of Heilongjiang Province of China，Harbin 150030，China）

AbstractThe pathogens causing soybean root rot in Heilongjiang Province were identified.Totally，296 fungal isolates were isolated from diseased plants collected from Harbin，Jiamus，Heihe，Qiqihaer，and Jixi regions，and these isolates were identified as 10 fungal species，Fusarium oxysporum，F.solani，F.equiseti，F.verticillioides，F.semitectum，Phomopsis longicolla，Pythium aphanidematum，Rhizoctonia solani，F.graminearum，F.chlamydosporum，and the proportion was 68.24%，7.09%，5.41%，4.05%，3.38%，3.38%，3.04%，2.70%，2.03%and 0.68%，respectively.Virulence test of the Fusarium isolates showed that 23.42%isolates were moderately or highly virulent to soybean variety.‘Hefeng 25’，with disease index of over 30 and F.oxysporum occupied for 18.22%.Among those isolates with disease index of over 30，F.oxysporum occupied for 77.78%.The high virulent isolates were found in different geographic regions with uneven distribution in Heilongjiang Province.The higher virulent isolates from soybean‘Hefeng 25’at flower bud differentiation period occupied higher proportion than those at seed filling stage.This study laid a foundation for field control and resistant variety screening to soybean root rot.

Key wordssoybean； root rot； pathogen； Fusarium oxysporum； virulence