2011－2012年三种水稻矮缩病在我国的分布及发生调查

饶黎霞， 王震成， 吴建祥， 周雪平

（浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，国家水稻生物学重点实验室，杭州 310058）

2011－2012年三种水稻矮缩病在我国的分布及发生调查

饶黎霞， 王震成， 吴建祥*， 周雪平*

（浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，国家水稻生物学重点实验室，杭州 310058）

摘要水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒均可以引起水稻矮缩病。于2011－2012年，利用dot-ELISA和RT-PCR方法对江苏、浙江、江西、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、湖南等省的水稻矮缩病进行调查。检测结果表明，2011年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒10.92%，南方水稻黑条矮缩病毒30.67%，水稻齿叶矮缩病毒4.62%。2012年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒0.40%，南方水稻黑条矮缩病毒48.38%，水稻齿叶矮缩病毒26.32%。检测结果说明2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害重于2011年，水稻黑条矮缩病害轻于2011年。水稻黑条矮缩病主要发生于江苏、浙江等省；南方水稻黑条矮缩病主要在广西、海南、云南、贵州、重庆、浙江等省区流行；水稻齿叶矮缩病在广西、海南、云南等地均有发生，且往往与南方水稻黑条矮缩病毒复合感染。

关键词水稻黑条矮缩病毒； 南方水稻黑条矮缩病毒； 水稻齿叶矮缩病毒； dot-ELISA； RT-PCR

水稻病毒病是水稻上的重要病害之一。侵染我国水稻引起矮缩症状的病毒主要有水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streakeddwarf virus，SRBSDV）、水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV），目前这3种病毒病严重危害我国的水稻生产，是防控上的重点。

RBSDV属呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）［1］，主要经灰飞虱（Laodelphax striatellus）传播，一经获毒终身带毒，不通过卵传给下一代［2］。RBSDV能侵染水稻、玉米、麦类等禾本科植物，引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病、小麦绿矮病［3］。20世纪50年代该病害在我国首次报道后，迄今为止已在我国至少16个省、自治区发生。2008年该病害又突然在山东、浙江、江苏、安徽、江西等省暴发，危害严重。

SRBSDV于2001年由周国辉等在广东阳西县首次发现，是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）一个新的暂定种，主要的传播介体是白背飞虱（Sogatella furcifera）［4］。2008年扩散至长江流域，2009－2010年在我国南方地区暴发成灾。据不完全统计，2010年受灾水稻种植面积超过30万hm2，失收面积超过6 500 hm2，是一次发生在水稻上的重大灾害［5］。此外，该病害也在越南北部造成了严重的危害，据2009年的调查显示，越南北部19个省发病面积达到33.33万hm2，绝收面积约0.67 hm2［6］。

RRSV为呼肠孤病毒科（Reoviridae）水稻病毒属（Oryzavirus）成员，以褐飞虱为其主要传毒媒介，褐飞虱以持久性方式传播病毒［7］。1978年在我国首次发现以来，先后在湖南、浙江、江西、福建、广东和台湾等地检出，但发病率较低。1980年后，田间常难以发现病株。2005年福建省再度检出水稻齿叶矮缩病，近年呈上升趋势，重病田产量损失达80%～90%［8-9］。

本研究对2011－2012年江苏、浙江、江西、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、湖南等地上述3种病毒病暴发流行重点区域进行调查，采集具有矮缩症状的水稻及稻飞虱样本，通过dot-ELISA、RTPCR及核酸测序进行病原的鉴定检测，初步了解其发生、流行情况，为我国水稻病毒病的预警预报及科学防控体系的建立打下基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

水稻样品为2011－2012年我国南方稻区（江苏、浙江、江西、湖南、重庆、四川、云南、贵州、广西、海南等）表现矮缩症状的疑似感病水稻。

稻飞虱样品来源于2011－2012年我国病害暴发重点区域（江苏、浙江、广西、海南、云南、贵州、重庆、四川、湖南等）。

1.2 RT-PCR检测

根据GenBank数据库报道的3种病毒CP序列设计特异性引物：SRBSDV-F：TGCACTTAGAAAAGGAGTCG，SRBSDV-R：TGCAGTGGTAGCTTTCTTA；RBSDV-F：CACGTTGCGCACTAATTACG，RBSDV-R：GGCGGAAAGTGCCTTCTTT；RRSV-F：ACCGTCGTTGAGCTACCATCCATT，RRSV-R：GGCGGGCCACTCAAACCAT。采用Trizol试剂（Invitrogen）提取水稻总RNA。利用天根公司的FastQuantcDNA第一链合成试剂盒反转录合成病毒RNA的cDNA第一链。PCR反应体系如下：2×Master Mix（Sigma）12.5μL、5′和3′引物各0.5μL、1μL反转录模板、dd H2O 10.5μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，设置相应的退火温度退火30 s（SRBSDV 48℃，RBSDV 51℃，RRSV 52℃），SRBSDV、RBSDV均延伸45 s，RRSV延伸30 s，进行32个循环，最后一个循环后72℃再延伸10 min。取4μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳分析。部分样品的PCR产物进行核酸序列测定。

1.3 dot-ELISA检测

dot-ELISA步骤参考刘欢、Wu等［10-11］，即取2μL病毒样品研磨液上清或2μL单头稻飞虱捣碎液点于硝酸纤维素膜（NC膜），植株样品分别用感病叶及健康叶作阳性和阴性对照，稻飞虱样品分别用带毒飞虱和不带毒飞虱作阳性和阴性对照；点样后的NC膜室温晾干15 min；膜用含5%脱脂奶粉的封闭液37℃封闭30 min后，加入适当稀释的相应病毒单抗（本实验室制备）作为一抗，37℃孵育1 h；PBST缓冲液洗涤3～4次后将膜移入适当稀释的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG的二抗中（Sigma公司产品）于37℃反应1 h；洗涤4～5次，用NBT／BCIP（植株样品）、TMB（稻飞虱样品）底物显色10～30 min，观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 dot-ELISA在水稻和稻飞虱检测上的应用及与RT-PCR的吻合率

分别对疑似感染SRBSDV、RBSDV、RRSV的3批水稻样品进行dot-ELISA、RT-PCR及核酸序列检测。结果为：SRBSDV的检测中，检测到12个病毒阳性标样（图1），与RT-PCR、核酸序列测定结果基本吻合，吻合率约95.45%。RBSDV的检测中，检测到10个病毒阳性标样（图2），与RT-PCR、核酸序列检测结果完全吻合，吻合率100%。RRSV的检测中，检测到6个病毒阳性标样（图3），与RTPCR、核酸序列检测吻合率90.00%。

图2 水稻中RBSDV的dot-ELISA检测结果Fig.2 Detection of RBSDV in field rice samples by dot-ELISA

图3 水稻中RRSV的dot-ELISA检测结果Fig.3 Detection of RRSV in field rice samples by dot-ELISA

对饲毒稻飞虱样品进行dot-ELISA检测。34头白背飞虱样品中检测出9头呈蓝色斑点反应，带毒率约26.47%（图4）。34头褐飞虱样品中检测出8头呈蓝色斑点反应，带毒率约23.53%（图5）。

图4 dot-ELISA检测白背飞虱体内SRBSDV结果Fig.4 Detection of SRBSDV in field whitebacked planthopper samples by dot-ELISA

图5 dot-ELISA检测褐飞虱体内RRSV结果Fig.5 Detection of RRSV in field brown planthopper samples by dot-ELISA

以上结果说明本实验室建立的病毒检测体系已非常完善，且dot-ELISA检测体系已达到了较高的灵敏度和准确度，可以弥补RT-PCR的不足，用于田间样品的高通量检测。

2.2 2011年RBSDV、SRBSDV、RRSV三种水稻病毒病的发生情况

2011年对江苏、浙江、广西、云南、贵州、四川、重庆、湖南等省（市）水稻病害进行调查。采用dot-ELISA、RT-PCR及核酸测序的方法，检测了矮缩症状的水稻样本238份，检测结果显示水稻黑条矮缩病毒检出率10.92%，南方水稻黑条矮缩病毒检出率30.67%，水稻齿叶矮缩病毒检出率4.62%。其中江苏省仅检出水稻黑条矮缩病毒，带毒率83.33%。浙江省水稻黑条矮缩病毒检出率64.71%。云南、广西南方水稻黑条矮缩病毒检出率分别为31.94%和 62.50%，水稻齿叶矮缩病毒检出率分别为13.89%和3.13%。贵州、重庆仅检出南方水稻黑条矮缩病毒，带毒率分别为43.28%和7.69%。四川、湖南两省未检测到以上3种病毒（表1）。说明由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病江苏、浙江等省的局部地区发生严重。由南方水稻黑条矮缩病毒引起的南方水稻黑条矮缩病在我国广西、云南、贵州、重庆等省（市、区）的局部地区均有发生，尤其在广西的兴安县，云南的施甸县，贵州的贵定县、荔波县等地暴发成灾。由水稻齿叶矮缩病毒引起的水稻齿叶矮缩病在我国广西、云南等地均有发生，且往往与SRBSDV复合感染水稻。

表1 2011－2012年田间水稻三种病毒的检测结果Table 1 Detection results of three viruses in field rice samples collected in 2011－2012

在稻飞虱的带毒调查中检测了2011年7－9月广西、云南、贵州、四川、重庆等五省（市、区）南方水稻黑条矮缩病毒暴发流行热点区白背飞虱。采用dot-ELISA的方法共检测白背飞虱620头，结果显示携带南方水稻黑条矮缩病毒检出率3.50%。其中云南省检测稻飞虱总数量240头，带毒数11头，带毒率4.60%；广西壮族自治区检测的稻飞虱总数量40头，其中带毒数2头，带毒率5.00%；贵州省检测的稻飞虱总数量155头，其中带毒数6头，带毒率3.90%；四川省检测的稻飞虱总数量60头，其中带毒数0头，带毒率0.00%；重庆市检测的稻飞虱总数量15头，其中带毒数0头，带毒率0.00%（表2）。

表2 2011年7－9月田间白背飞虱体内SRBSDV检测结果Table 2 Detection result of SRBSDV in field white-backed planthoppers collected from July to September in 2011

2.3 2012年RBSDV、SRBSDV、RRSV三种水稻病毒病的发生情况

2012年对江苏、浙江、江西、广西、海南、云南等省的水稻病害进行了调查。采用dot-ELISA、RTPCR及核酸测序的方法检测了以矮缩症状为主的水稻样本494份，结果表明：水稻黑条矮缩病毒检出率0.40%，南方水稻黑条矮缩病毒检出率48.38%，水稻齿叶矮缩病毒检出率26.32%。其中江苏省主要为水稻黑条矮缩病毒，检出率40.00%。浙江省仅检测出南方水稻黑条矮缩病毒，检出率72.22%。江西省均未检测到以上3种病毒。广西、海南两省（区）检测到南方水稻黑条矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒及这两种病毒复合侵染，其中南方水稻黑条矮缩病毒检出率分别为89.66%、48.48%，水稻齿叶矮缩病毒检出率分别为13.79%、34.85%。云南检测到南方水稻黑条矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒及其复合侵染情况，其检出率分别为南方水稻黑条矮缩病毒36.70%，水稻齿叶矮缩病毒10.09%（表1）。表明由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病主要在华东地区江苏等省的局部地区发生。由南方水稻黑条矮缩病毒引起的南方水稻黑条矮缩病在我国的浙江、广西、海南、云南等省（区）的局部地区均有发生，尤其在海南省的三亚、澄迈、文昌等地更是暴发成灾。由水稻叶矮缩病毒引起的水稻齿叶矮缩病在我国广西、海南、云南等地均有发生。

2012年在稻飞虱的带毒调查中检测了江苏、浙江、广西、海南、云南和湖南等六省（区）的稻飞虱样品。共检测白背飞虱5 496头，携带南方水稻黑条矮缩病毒检出率0.74%。褐飞虱709头，携带水稻齿叶矮缩病毒检出率0.14%。其中检测江苏省白背飞虱58头，未检测出带毒飞虱。检测浙江省白背飞虱534头，带毒数7头，带毒率1.31%。检测广西壮族自治区白背飞虱2 409头，带毒数48头，带毒率1.99%。检测海南省白背飞虱207头，带毒数2头，带毒率0.97%。检测云南省白背飞虱2 188头，带毒数8头，带毒率0.37%。检测湖南省白背飞虱100头，未检测出带毒飞虱（表3）。在2012年5月16日至7月28日对广西桂林水稻种植区白背飞虱连续监测发现5月16日至30日很少检出带毒白背飞虱，从5月31日开始连续检出一定的带毒率。其中重病田的白背飞虱带着检出率高达27.55%（图6）。由于之前在海南的水稻中检测到了较高的水稻齿叶矮缩病毒带毒率，猜想其传毒介体褐飞虱极有可能也具有一定的带毒率，经过采样检测，从709头褐飞虱中检测到1头带毒阳性，带毒率0.14%（表3）。

表3 2012年田间稻飞虱体内两种水稻病毒检测结果Table 3 Detection results of two rice viruses in field rice planthopper samples collected in 2012

图6 对广西桂林2012年5月16日－7月28日采集的白背飞虱SRRSDV带毒率的监测Fig.6 Infection rates of SRRSDV in white-backed planthopper samples collected in Guilin of Guangxi from 16 May to 28 July in 2012

2.4 2011－2012年三种水稻病毒病发生情况比较

通过对2011－2012年我国广大稻区的样品检测，结果表明2011年水稻带毒率为：水稻黑条矮缩病毒10.92%，南方水稻黑条矮缩病毒30.67%，水稻齿叶矮缩病毒6.30%。2012年水稻带毒率为：水稻黑条矮缩病毒0.40%，南方水稻黑条矮缩病毒48.38%，水稻齿叶矮缩病毒26.32%。初步推测，2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害均重于2011年，水稻黑条矮缩病害轻于2011年（图7）。

图7 2011－2012年三种病毒病在水稻样品中的感染率Fig.7 Infection rates of three viruses in field rice samples collected in 2011 and 2012

3 讨论

从田间调查和疑似感病水稻及其传毒介体稻飞虱的检测结果来看，RBSDV、SRBSDV、RRSV三种病毒仍然是最近几年我国水稻生产上的主要威胁。水稻黑条矮缩病害的田间症状与南方水稻黑条矮缩病害非常类似，其差别主要表现在南方水稻黑条矮缩病株会产生高位分蘖且茎节部有倒生根。同时它们的主要传毒介体灰飞虱（RBSDV的传毒介体）和白背飞虱（SRBSDV的传毒介体）分布区域的不同导致了两种病害发生范围很不一样。我国江苏、浙江等省主要发生水稻黑条矮缩病害。浙江的局部地区、广西、海南，西南地区的云南、贵州和重庆等省（市、区）则是南方水稻黑条矮缩病害的重点暴发流行区。水稻齿叶矮缩病毒常与南方水稻黑条矮缩病毒复合侵染水稻，其主要传毒介体为褐飞虱，在我国分布广泛。RT-PCR和dot-ELISA是检测水稻病毒最常用的两种方法，本文证实了本实验室建立的dot-ELISA检测体系具有很高的准确性和灵敏度，可以与RT-PCR、核酸测序共同用于病毒样品的检测。同时又由于它操作简便且不需要复杂的仪器，克服了RT-PCR不易推广的不足之处，更适用于基层样品的高通量检测，为田间病毒病害的鉴定及预测预报打下了基础。通过对2011－2012年的田间样品进行病毒检测，结果显示2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害均重于2011年，而水稻黑条矮缩病害轻于2011年。病害发生的严重程度一般主要与当年的气候条件及传毒介体数量和带毒率等因素有关。本文检测结果中2012年白背飞虱的带毒率（0.74%）低于2011年3.5%，原因可能是受样品采集时间的影响，2012年采虫时间较早，稻飞虱样品主要来源于5－6月，而2011年的稻飞虱样品主要来源于7－8月。从病害流行学的角度分析，一般7－8月是病害暴发的高峰期，这段时期的稻飞虱带毒率往往是最高的。此外在对2012年5月16日－7月28日广西桂林水稻种植区白背飞虱的连续监测中也证实了6月以后的带毒率要明显高于6月之前。

参考文献

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中图分类号：S 435.111.49

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.028

收稿日期：2013-07-18

修订日期：2013-08-07

基金项目：国家重点基础研究发展计划（国家“973计划”）（2010CB126203）；公益性行业（农业）科研专项经费（201003031）；农业产业技术体系科研专项经费（nycytx-001）

*通信作者E-mail：wujx＠zju.edu.cn，zzhou＠zju.edu.cn

Investigation of distributions and occurrences of three rice dwarf diseases in China in 2011－2012

Rao Lixia， Wang Zhencheng， Wu Jianxiang， Zhou Xueping
（State Key Laboratory of Rice Biology，Institute of Biotechnology，College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

AbstractAll Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV），Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）and Rice ragged stunt virus（RRSV）can cause rice dwarf disease.The occurrence and distribution of three rice dwarf diseases in Jiangsu，Zhejiang，Jiangxi，Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou，Sichuan，Chongqing and Hunan provinces during 2011－2012 were investigated with dot-ELISA and RT-PCR detection methods.The results showed that infection rates of the three viruses（RBSDV，SRBSDV and RRSV）were 10.92%，30.67%and 4.62%for rice samples collected in 2011，and 0.40%，48.38%and 26.32%for rice samples collected in 2012，respectively，indicating that the occurrences of SRBSDV and RRSV in 2012 were severer than those in 2011，while the RBSDV disease in 2012 was lighter than that in 2011.RBSDV occurred mainly in Jiangsu and Zhejiang provinces，SRBSDV occurred mainly in Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou，Chongqing and Zhejiang，while RRSV occurred mainly in Guangxi，Hainan，Yunnan，Guizhou and Chongqing，and often co-infected with SRBSDV.

Key wordsRice black-streaked dwarf virus； Southern rice black-streaked dwarf virus； Rice ragged stunt virus；dot-ELISA； RT-PCR