黄瓜绿斑驳花叶病毒磁免疫层析试纸条的研制

魏梅生， 李桂芬， 马 洁， 朱水芳， 王军平， 文朝慧

（1.中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所，北京 100029；2.甘肃出入境检验检疫局，兰州 730020）

黄瓜绿斑驳花叶病毒磁免疫层析试纸条的研制

魏梅生1， 李桂芬1， 马 洁1， 朱水芳1， 王军平2， 文朝慧2

（1.中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所，北京 100029；2.甘肃出入境检验检疫局，兰州 730020）

摘要用磁性纳米颗粒标记黄瓜绿斑驳花叶病毒的兔多克隆抗体建立了简便快速的磁免疫层析试纸条检测方法。该方法检测提纯病毒的灵敏度为0.1μg／m L，检测葫芦病汁液可稀释10 000倍（重量／体积）。试纸条和黄瓜绿斑驳花叶病毒具有特异性反应，和同属的烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒和齿兰环斑病毒，未出现交叉反应。该试纸条可用于田间病害检测和诊断。

关键词黄瓜绿斑驳花叶病毒； 磁免疫层析； 试纸条

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）为烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员，是全国农业植物检疫性有害生物和我国进境检疫性有害生物。CGMMV主要危害葫芦科作物，引起植物叶片斑驳、系统性花叶等症状，造成产量和品质下降，对生产危害很大［1］。

该病毒分布于英国、以色列、西班牙、希腊、沙特阿拉伯、印度、巴基斯坦、韩国和日本等国家和地区［2］。根据我国农业部公布的《2012年全国农业植物检疫性有害生物分布行政区名录》，国内辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、湖北、湖南、广东、广西［3］、海南等10个省（区、市）59个县（市、区）有CGMMV的分布。

早期诊断和发现田间CGMMV，采取有效的检疫处理措施，可避免病害的进一步扩散蔓延［4-5］。目前，用于CGMMV快速检测方法主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay，GICA），可在15 min内得到检测的结果。胶体金免疫层析采用胶体金来标记特异性的检测抗体，利用胶体金的呈色性用肉眼判别检测的结果，但胶体金结果的判断有时会受到植物叶绿素的干扰。磁纳米颗粒（magnetic nanoparticles）是一种新型纳米材料，其核心是由具有超顺磁性的（superparamagnetic）Fe3O4或铁磁性的（ferromagnetic）γ-Fe2O3组成。超顺磁性纳米材料具有在外加磁场的作用下能迅速聚集，在无磁场的情况下能够均匀分散的特点，表面功能化的磁性纳米材料可用于蛋白质、DNA和RNA等生物大分子的纯化以及细胞、病原微生物的分离和检测［6］，如用于检测人类免疫缺陷病毒的抗体，定量检测人乙型肝炎表面抗原以及农药的测定［7-9］。这种磁性纳米材料呈棕色具有磁信号可供检测。

本文以CGMMV为材料，利用磁性纳米材料的磁性去分离病毒，并根据其颜色判断磁免疫层析（magnetic immunochromatography assay）试纸条的测试结果。

1 材料与方法

1.1 病毒毒原

黄瓜绿斑驳花叶病毒为辽宁盖州分离物。病毒摩擦接种繁殖于葫芦（Lagenaria siceraria）上。病毒的提纯见参考文献［10］。

1.2 主要试剂和设备

黄瓜绿斑驳花叶病毒兔多克隆抗体为本所自制，经1 m L HiTrap Protein G（GE公司）柱纯化。羊抗兔抗体购自军事医学科学院微生物流行病研究所。磁性纳米材料为Chemicell公司的fluid MAGUC／A（100 nm）。层析膜为Millipore公司的产品HiFlow Plus HFB 13502（货号HF13502S25）。磁力分离架为Bioreba公司产品。

1.3 磁纳米颗粒-抗体结合物的制备

取25μg纯化的CGMMV兔多克隆抗体加入到400μL的蒸馏水中，在其中加入100 nm的fluid MAG-UC／A纳米颗粒1 mg，室温条件下振荡孵育1 h后，即为标记好的抗体-磁性纳米颗粒。置4℃冰箱保存备用。

1.4 试纸条的制作

1.4.1 抗体固相硝酸纤维素（层析）膜的制备

CGMMV兔多克隆抗体和羊抗兔抗体用固相溶液（0.02 mol／L p H8.0磷酸盐缓冲液）分别稀释成2 mg／m L和8 mg／m L的浓度。在BioDot XYZ 3050三维喷点平台上，用BioJet Quanti 3000非接触式微定量喷头，将上述两种抗体均匀地喷在硝酸纤维素膜上，形成粗细适中的两条平行线，分别为T检测线和C质控线。将固相抗体硝酸纤维素膜置封闭液（1%脱脂奶粉）中，37℃水浴锅中孵育1 h，其后在0.02 mol／L p H7.0的磷酸盐缓冲液中洗涤2次，室温下风干，置4～8℃保存备用。

1.4.2 试纸条的组装

在80 mm×300 mm双面胶塑料板25 mm端内侧黏附25 mm×300 mm抗体固相硝酸纤维素膜。在双面胶塑料板25 mm端黏附20 mm×300 mm玻璃纤维素纸条带，并与抗体固相NC膜重叠2 mm，再黏附一层标有MAX线的胶带。在双面胶塑料板30 mm端黏附25 mm×300 mm宽的吸水纸与抗体固相硝酸纤维素纸重叠2 mm，并黏附一层胶带。用BioDot CM4000切条机切成4 mm宽的试纸条。

1.5 磁免疫层析试纸条检测和结果判断

1.5.1 样品制备

病叶或健康叶片称重后用0.01 mol／L p H7.2磷酸盐缓冲液稀释，经研磨并低速离心后为制备好的样品，提纯的病毒也用上述缓冲液稀释。

1.5.2 测试和结果判断

在500μL的塑料离心管中加入100μL的病叶或健康叶汁液，400μL的蒸馏水和40μL的磁纳米颗粒-抗体结合物，充分混匀，静置5 min，充分振荡后放在磁力分离架上静置3 min，待磁性纳米颗粒吸附在离心管壁上，吸出离心管中的溶液，再加入400μL的蒸馏水将磁性纳米颗粒充分悬浮起来。

取出试纸条恢复至室温，将标有MAX线的一端插入到上述检测样品中，10 min左右判断结果。若试纸条C线出现棕色线而T线未显色，结果为阴性；若试纸条上C线和T线均出现棕色，结果为阳性；若试纸条C线和T线都没有显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

2 结果

2.1 磁分离的结果

所用的普通磁力分离架可有效地将棕色磁纳米颗粒吸附在离心管壁上，并和样品溶液中的叶绿素分开（见图1）。

2.2 磁免疫层析试纸条特异性测试

用CGMMV磁免疫层析试纸条检测黄瓜绿斑驳花叶病毒，C线和T线均出现棕色，结果呈阳性反应；交叉检测同属的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，To MV），辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMo V），齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV），仅C线出现棕色，T线未出现棕色，结果是阴性；试纸条对健康和缓冲液对照检测的结果，仅C线出现棕色，T线未出现棕色，结果是阴性。结果说明磁免疫层析试纸条检测的特异性强。

图1 外磁场作用后管壁聚集的磁纳米颗粒Fig.1 Magnetic nanoparticles accumulated at the tube wall by an external magnetic field

2.3 磁免疫层析试纸条检测灵敏度

磁免疫层析试纸条检测提纯的CGMMV灵敏度可达0.1μg／m L（见图2）；检测CGMMV葫芦病叶汁液可稀释10 000倍（W／V）（见图3），健康对照T线未显色避免了植物叶绿素的干扰。

图2 磁免疫层析试纸条检测提纯的CGMMVFig.2 Detection of the purified CGMMV by magnetic immunochromatography assay

图3 磁免疫层析试纸条检测CGMMV病叶汁液Fig.3 Detection of CGMMV in the extract of the infected Lagenaria siceraria leaves by magnetic immunochromatography assay

2.4 和胶体金试纸条测试的比较

胶体金试纸条检测提纯的CGMMV灵敏度可达0.1μg／m L（见图4）；检测CGMMV葫芦病叶汁液可稀释10 000倍（W／V），但健康对照在T线上，受植物叶绿素的干扰有时会出现绿色的线（见图5）。

图4 胶体金免疫层析试纸条检测提纯的CGMMVFig.4 Detection of the purified CGMMV by GICA

图5 胶体金免疫层析试纸条检测CGMMV病叶汁液Fig.5 Detection of CGMMV in the extract of the infected L.siceraria leaves by GICA

3 讨论

直径小于100 nm磁性纳米颗粒，由于需要用更强的磁场来分离，普通的磁力分离架难以使超顺磁性纳米材料迅速聚集起来，因此本文选用直径100 nm带有负电荷的磁性纳米材料来标记抗体，标记是靠物理吸附作用来实现的，这种磁性纳米材料远大于标记用胶体金的20～30 nm［11］大小的颗粒，分散系中的盐等电解质，极易造成磁性纳米颗粒的聚集和沉淀，致使颗粒在层析膜上行走不畅，到达不了C、T线，从而影响检测的结果，因此在抗体的标记和样品的检测过程中要避免使用高浓度的盐溶液。

本研究所制作的CGMMV磁免疫层析试纸条检测提纯病毒可达0.1μg／m L，检测病叶汁液可稀释10 000倍（W／V），检测灵敏度和胶体金试纸条相当，并且可有效避免植物叶绿素对检测结果的影响，具有检测快速，灵敏度高，特异性强的优点，可用于对该病毒的田间调查和疫情监测。本研究主要通过肉眼来观察检测的结果，而磁信号的检测可用于病毒的定量检测，可进一步提高检测的灵敏度。

参考文献

［1］ 冯兰香，谢丙炎，杨宇红，等.检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防疫控制［J］.中国蔬菜，2007（9）：34-38.

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［3］ 秦碧霞，蔡健和，刘志明，等.侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒的初步鉴定［J］.植物检疫，2005，19（4）：198-200.

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［9］ Liu C Y，Jia Q J，Yang C H，et al.Lateral flow immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4nanoparticle aggregates as color reagents［J］.Analytical Chemistry，2011，83：6778-6784.

［10］李桂芬，马洁，陈红运，等.黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用［J］.河南农业科学，2007（11）：76-78.

［11］魏梅生，刘洪义，李桂芬，等.马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制［J］.植物保护，2006，32（6）：139-141.

联系方式 Tel：010-85393944；E-mail：xsms2013＠163.com

中图分类号：S 41

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.019

收稿日期：2013-07-17

修订日期：2013-08-21

基金项目：公益性行业（质检）科研专项（201310071）

Magnetic immunochromatography assay for rapid detection of Cucumber green mottle mosaic virus

Wei Meisheng1， Li Guifen1， Ma Jie1， Zhu Shuifang1， Wang Junping2， Wen Zhaohui2
（1.Institute of Plant Quarantine，CAIQ，Beijing 100029，China；2.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China）

AbstractRapid magnetic immunochromatography assay was developed by coupling magnetic nanoparticles with polyclonal rabbit antibody against Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）.Sensitivity of the method was 0.1μg／m L for detecting purified CGMMV.CGMMV could be detected in the extract of the infected Lagenaria siceraria leaves at a dilution of 10－4（W／V）.The immunostrip was specific to CGMMV，without cross reaction with other tobamoviruses such as Tobacco mosaic virus，Tomato mosaic virus，Pepper mild mottle virus and Odontoglossum ringspot virus.The immunostrip is an ideal screening tool for field inspection and disease diagnosis.

Key wordsCucumber green mottle mosaic virus； magnetic immunochromatography assay； immunostrip