大孔树脂对内生菌011发酵液中抗菌成分的吸附和解吸特性研究

周金伟， 易有金*， 柏连阳， 曹 熙， 田 建， 程远渡

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，长沙 410128；2.湖南省食品科学与生物技术重点实验室，长沙 410128；3.湖南农业大学生物安全学院，长沙 410128）

大孔树脂对内生菌011发酵液中抗菌成分的吸附和解吸特性研究

周金伟1，2， 易有金1，2*， 柏连阳3， 曹 熙1，2， 田 建1，2， 程远渡1，2

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，长沙 410128；2.湖南省食品科学与生物技术重点实验室，长沙 410128；3.湖南农业大学生物安全学院，长沙 410128）

摘要011是从烟草茎中分离得到的一株对植物病原真菌有强烈抑制作用的内生细菌，为了明确其发酵液中的抗菌活性成分，并探索活性成分的大孔树脂吸附条件，本试验采用X-5型、AB-8型和CAD-40型3种树脂对其发酵产物进行了吸附与解吸试验，探讨树脂类型、上样量、解吸剂、解吸剂体积分数及p H对吸附与解吸效果的影响。结果表明，在3种树脂中，CAD-40型树脂的吸附率及解吸率均显著高于X-5型和AB-8型树脂，其最佳上样量为树脂质量的15倍。选择70%的乙醇在p H为7时能获得最佳的解吸效果。

关键词内生菌； 抗菌活性； 大孔树脂； 吸附率； 解吸率

植物内生菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织中，不引起宿主植物出现明显症状的微生物［1］。植物内生菌能产生多种生物活性物质［2］，包括生物碱、抗菌肽、甾体、萜类、酚类等，这些物质大多具有抗菌活性［3］。因此，植物内生菌被称为天然活性物质合成的生物工厂［4］。从植物内生菌代谢产物中分离生物活性物质在农业、医疗卫生和工业上具有广阔的应用前景。

011菌是从烟草组织中分离得到的一株内生细菌，前期研究结果表明，该菌对烟草青枯病具有良好的防治效果［5］。然而，其产生的抗菌物质尚不明确，且其产物成分复杂，增加了分离纯化的难度，因此有必要对其活性成分进行初步纯化。

大孔吸附树脂为一种选择性有机高聚吸附剂，具有吸附量大、选择性好、吸附速度快、再生简便等优点，被广泛用于天然产物的分离纯化［6］。本文基于011菌发酵液的抗菌活性，筛选大孔吸附树脂，优化吸附和解吸条件，为抗菌活性物质的进一步分离纯化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

内生短短芽胞杆菌011由湖南农业大学食品科学与生物技术湖南省重点实验室分离、鉴定与保藏。供试真菌辣椒疫病菌（Phytophthora capsici Leonlan）由湖南农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2 培养基

BPY液体培养基、PDA固体培养基［7］。

1.1.3 主要试剂

大孔吸附树脂：X-5型、AB-8型和CAD-40（安徽三星树脂科技有限公司），树脂性能见表1；乙醇、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。

表1 三种吸附树脂的物理性能Table 1 Physical properties of three types of macroporous resins

1.2 方法

1.2.1 011菌株发酵液的制备及预处理

种子液制备：将斜面保存的011菌株接入BPY培养液中，装液量100 m L／250 m L，p H 7.0、30℃、180 r／min振荡培养24 h。

发酵培养：种子液以1%接种量接种到BPY培养基中，装液量100 m L／250 m L，p H 7.0、30℃、180 r／min振荡培养48 h。

发酵液预处理：所得发酵液于60℃水浴浓缩，去除2倍体积的水，10 000 r／min离心10 min，去除菌体，上清液用0.45μm滤膜除菌，得发酵滤液备用。

1.2.2 011菌株发酵液抑菌活性的测定

抑菌活性采用平皿打孔法［8-9］：将辣椒疫病菌饼接种于PDA培养基中央，28℃下培养24 h，在离菌落边缘2.0 cm处打孔（d＝6 mm），每孔加100μL发酵滤液，以无菌水作为空白对照，28℃培养48 h，测量抑菌圈大小，计算抑菌率，3次重复。

式中，Dc为处理菌落半径；Dd为对照菌落半径。

1.2.3 大孔树脂静态吸附率及解吸率测定

根据极性强弱，选择3种大孔吸附树脂，分别为X-5（非极性）、AB-8（弱极性）及CAD-40（中极性）。取3种活化好的树脂各1 g，加入到50 m L三角瓶中，每瓶加入发酵滤液20 m L。30℃、180 r／min振荡吸附4 h。吸附后，分开滤液与树脂，蒸馏水洗去多余残液，加入75%乙醇20 m L，30℃、180 r／min振荡解吸4 h。解吸液于60℃减压浓缩至干，加10 m L无菌水溶解，以发酵滤液为对照，平皿打孔法测定吸附残液及解吸液抑菌活性，计算各吸附树脂的吸附率及相对解吸率。

式中Qa—吸附率；C1—吸附残液抑菌圈半径；C2—发酵滤液抑菌圈半径；Qb—相对解吸率；C3—解吸液抑菌圈半径。

1.2.4 吸附量优化

取活化好的CAD-40树脂各1 g，置于50 m L三角瓶中，每瓶分别加入5、10、15、20、25、30 m L发酵滤液，振荡吸附同前。吸附后，以发酵滤液为对照，平皿打孔法测定吸附残液抑菌活性，计算吸附率。

1.2.5 大孔树脂解吸剂的筛选

取活化好的CAD-40树脂各1 g，置于50 mL三角瓶中，每瓶分别加入15 mL发酵滤液，振荡吸附同前。吸附后，分开滤液与树脂，蒸馏水洗去多余残液，分别加入70%甲醇、70%乙醇及70%丙酮15 m L，30℃、180 r／min振荡解吸4 h。解吸液于60℃减压浓缩至干，加10 mL无菌水溶解，以发酵滤液为对照，平皿打孔法测定解吸液抑菌活性，计算相对解吸率。

1.2.6 乙醇体积分数对解吸的影响

取吸附饱和的CAD-40树脂7份，每份1 g，分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同体积分数的乙醇15 m L，30℃、180 r／min振荡解吸4 h。解吸液于60℃减压浓缩至干，加10 m L无菌水溶解，以发酵滤液为对照，平皿打孔法测定解吸液抑菌活性，每处理3次重复。

1.2.7 p H对CAD-40树脂解吸效果的影响

取吸附饱和的CAD-40树脂6份，每份1 g，各加入15 mL乙醇，调p H分别为2、4、6、7、8、10，30℃、180 r／min振荡解吸4 h。解吸液于60℃减压浓缩至干，加10 mL无菌水溶解，以发酵滤液为对照，平皿打孔法测定解吸液抑菌活性，每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 011菌株发酵滤液抑菌活性

图1结果表明，011菌发酵滤液对辣椒疫病菌有很好的抑制效果，随着稀释倍数的增加，其抑菌效果逐渐降低。发酵滤液、2倍稀释液、3倍稀释液的抑菌率分别为64.7%、57.6%和48.3%。

2.2 大孔树脂对发酵滤液抗菌成分的吸附和解吸性能比较

由表2可知，发酵滤液经X-5、AB-8及CAD-40型树脂吸附后的残液仍具有抑菌活性，表明抑菌物质难以被完全吸附。而在相同条件下，CAD-40型树脂的吸附率显著（P＜0.05）高于X-5、AB-8型树脂。

图1 011发酵滤液对辣椒疫病菌体外抑菌效果Fig.1 Inhibitory effects of the ferment of the strain 011 on Phytophthora capsici

用75%乙醇解吸后，3种树脂的相对解吸率均较高，而CAD-40型树脂的解吸率显著高于另外两种树脂（P＜0.05）。

表2 大孔树脂对发酵滤液抗菌物质的吸附及解吸性能1）Table 2 The adsorption and desorption capacities of three types of macroporous resins on the ferment of the strain 011

2.3 上样量对CAD-40吸附效果的影响

由图2可知，上样量影响CAD-40型树脂的吸附率。当上样量小于15 mL时，其吸附率为100%，达到吸附饱和。随着上样量的增加，其吸附率逐渐下降。因此，可以确定最佳上样量为树脂量的15倍。

图2 上样量对CAD-40型树脂吸附率的影响Fig.2 Effects of sample weight on the desorption rate of CAD-40

2.4 解吸剂对大孔树脂解吸性能的影响

分别用70%的甲醇、乙醇及丙酮对吸附后的CAD-40型树脂进行解吸，其结果见图3。由图3可知，相同浓度的甲醇、乙醇及丙酮对树脂的解吸率分别为79.4%、96.8%和87.3%，其中，乙醇的解吸率显著高于甲醇和丙酮（P＜0.05）。且乙醇的毒性相对较小，不会造成环境污染和人体伤害，因此，本试验拟选用乙醇作为初步纯化的解吸剂。

图3 解吸剂对CAD-40型树脂解吸率的影响Fig.3 Effects of eluant on the desorption rate of CAD-40

2.5 乙醇体积分数对解吸效果的影响

由图4可知，乙醇体积分数为70%时（p H＝6.6），抗菌活性成分有较好的解吸作用，解吸率为96.7%，达到最大值。当乙醇体积分数低于或高于70%时，解吸能力均逐渐下降，40%乙醇和无水乙醇的解吸率均只有33.3%。因此，70%乙醇可作为最佳解吸剂。

图4 乙醇体积分数对CAD-40型树脂解吸率的影响Fig.4 Effects of ethanol volume fraction on the desorption rate of CAD-40

2.6 p H对解吸效果的影响

由图5可知，p H为7时，CAD-40型树脂解吸率最高，达97.7%。p H升高或降低其解吸能力均下降。当p H低于6时，解吸率下降显著。p H为2时的解吸率只有43.9%。因此，p H为7利于抗菌活性物质的解吸，定为解吸p H。

图5 p H对CAD-40型树脂解吸率的影响Fig.5 Effects of p H on the desorption rate of CAD-40

3 结论与讨论

植物内生菌几乎存在于所有植物中，不仅能促进植物生长，而且其产生的天然产物可用作生防因子，用于植物病虫害的防治，成为新型杀菌剂研发的潜在资源和热点［10］。从植物内生菌代谢产物中筛选出抗菌、抗病毒、抗肿瘤等具有生物活性的天然产物是新药研究与开发的一条重要途径。

大孔树脂是20世纪60年代发展起来的有机高分子聚合物吸附剂，其操作条件温和、载量大、选择性好、易解吸，它在天然产物的分离、抗生素的纯化、生化药物研究及其他领域有广泛的应用［11-12］。Gao等［13］用大孔树脂从传统中药细辛中分离到黄芩苷。Zhang等［14］利用大孔树脂从竹叶的抗氧化物中分离到4种黄酮碳苷类化合物。国外应用大孔树脂分离、浓缩、纯化微生物药物，包括目前已知的各类抗生素［15-16］。

研究表明，树脂的孔径、比表面积、被分离物质以及树脂的极性是影响树脂吸附能力的重要因素［17］。本试验中，CAD-40的孔径及比表面积均小于X-5和AB-8，然而CAD-40属于中极性，X-5和AB-8分别属于非极性和弱极性，相同条件下，CAD-40型树脂的吸附率显著高于X-5、AB-8型树脂，这表明011发酵产物中的活性成分为极性较强的物质。大孔树脂具有一定的吸附饱和度，上样量低于或高于此值，会造成树脂或样品浪费。本试验中，当上样量为树脂质量的15倍时，CAD-40达到吸附饱和。解吸剂能使大孔树脂溶胀，减弱树脂与被吸附物质之间的吸附力。常用的解吸剂有低级醇、酮及其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮［18］。本试验中，相同条件下，乙醇的相对解吸率显著高于甲醇和丙酮，且考虑生产安全性，本试验选择乙醇作为解吸剂。70%的乙醇相对解吸率为96.7%，低于或高于此值，解吸率均下降，因此选用70%的乙醇作为解吸剂。p H为7时，CAD-40型树脂解吸率最高，p H升高或降低其解吸能力均下降。这表明，中性条件利于011活性物质的解吸。

本试验以辣椒疫病菌为指示菌，用大孔树脂对011菌发酵液抑菌活性物质进行了初步静态吸附和解吸研究，而对于活性成分的分离尚需结合硅胶色谱和HPLC等多种色谱手段，以期获得新型高效的抗菌化合物。

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中图分类号：S 476.8

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.009

收稿日期：2013-12-24

修订日期：2014-01-23

基金项目：国家自然科学基金项目（31071738，31000827）；湖南省教育厅重点项目（10A051）；湖南省自然科学基金项目（09JJ-3032）；湖南农业大学稳定人才科学基金项目（07WDI8）；湖南省研究生科研创新项目（CX2013B310）；长沙市科技局项目（K1308044-21）

*通信作者E-mail：yiyoujin＠163.com

Adsorption and desorption characteristics of macroporous resins to antifungal substances in the fermentation broth of endophytic bacterium 011

Zhou Jinwei1，2， Yi Youjin1，2， Bo Lianyang3， Cao Xi1，2， Tian Jian1，2， Cheng Yuandu1，2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China；3.College of Bio-Safety Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

AbstractEndophytic bacterium 011，isolated from healthy tobacco stem，had strong inhibitory effects on plant pathogenic fungi.In order to clarify its antifungal ingredients and establish adsorption and desorption conditions of bioactive substances，three types of macroporous resins X-5，AB-8 and CAD-40 were used to determine the effects of resin type，sample weight，desorption reagent，desorption reagent volume fraction and p H on the adsorption and desorption of bioactive substances.The results showed that CAD-40 exhibited the best adsorption and desorption capacity to bioactive substances，and the optimum static adsorption conditions were as followed：fermentation broth was loaded with 15 times of resin mass，and 70%ethanol was used as eluent with p H of 7 as eluent.

Key wordsendophyte； antifungal activity； macroporous resin； adsorption rate； desorption rate