HPLC法测定乌苏里瓦韦药材中 2种活性成分

王丽红， 宋琳琳， 吴宏斌， 赵 龙， 刘德江， 穆立蔷

（1.东北林业大学林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.佳木斯大学药学院， 黑龙江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大学生命科学院， 黑龙江 佳木斯 154007）

HPLC法测定乌苏里瓦韦药材中 2种活性成分

王丽红1，2， 宋琳琳2， 吴宏斌2， 赵 龙2， 刘德江3， 穆立蔷1*

（1.东北林业大学林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.佳木斯大学药学院， 黑龙江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大学生命科学院， 黑龙江 佳木斯 154007）

目的 建立 HPLC法测定乌苏里瓦韦药材中绿原酸和叶黄素的方法。 方法 测定绿原酸色谱条件为 Agilent E-clipse XDB-IIC18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） ， 流动相为乙腈-0.4% 磷酸溶液 （13 ∶87） ， 体积流量为 1.0 mL/min，进样量为 10 μL， 柱温为 25 ℃， 检测波长为 325 nm。 叶黄素色谱条件为 Agilent Eclipse C18柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 流动相为 100%甲醇， 柱温为室温， 体积流量为 1mL/min， 检测波长为 474 nm。 结果 绿原酸线性范围为 0.4～4.0 μg， 样品平均加样回收率为 100.3%， 方法精密度 RSD （n=5） 为 2.03%， 绿原酸含有量为 2.635 mg/g； 叶黄素线性范围为 1.0 ～100.0 μg， 样品平均加样回收率为 99.45%， 方法精密度 RSD （n=5） 为 1.90%， 叶黄素含有量为 110 μg/g。 结论 上述方法快捷、 简便、 准确、 专属性好、 灵敏度高。

乌苏里瓦韦； 绿原酸； 叶黄素； HPLC

乌苏里瓦韦，为蕨类水龙骨科瓦韦属植物乌苏里瓦韦Lepisorus ussuriensis（ Regel etMaack） Ching的全草， 生于海拔 800 m左右的山地树干或山坡荫处岩石上［1］。 《 贵州民间方药集》记载其药材名为射鸡尾，主治风湿疼痛、跌打伤肿、 清热、 治惊风。 《中华本草》、 《广西药用植物名录》、 《湖南药物志》、 《东北常用药用植物》 等记载该植物具有利尿、镇痛、止咳、活血的功效。并且这些地区的居民将其称为石茶、树茶，将其代茶饮用，治疗各种炎症疼痛［1-4］， 是一种常用的民间用药。 但至今未见对该种蕨类植物化学成分及质量分析的报道。为了弄清乌苏里瓦韦的有效物质基础，保证民间用药的安全及可控，课题组对其化学成分进行了研究，表明该植物中含有多种化学成分，主要活性成分为绿原酸、 叶黄素等。 课题组采用 HPLC法对乌苏里瓦韦中的绿原酸及叶黄素进行测定，拟为乌苏里瓦韦的质量控制和进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器、 试剂、 材料

安捷伦 1100 型高效液相色谱仪 （四元泵、 自动进样器、 恒温箱和 DAD检测器）、 安捷伦液相色谱工作站； 凌光 UV7547CRT紫外可见分光光度计等。

实验材料于 2012 年 7 月中旬采自黑龙江省汤原县鹰山。经佳木斯大学药学院王丽红教授鉴定为蕨类水龙骨科瓦韦属植物乌苏里瓦韦的全草。将材料洗净，阴干。将干燥药材粉碎， 过40目筛， 备用。

绿原酸对照品 （纯度 98%， 中国药品生物制品检定所）； 叶黄素对照品 （纯度 90%， sigma公司）。 乙腈、 甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯；异丙醇、丙酮为分析纯；哇哈哈纯净水。

2 方法和结果

2.1 绿原酸的测定

2.1.1 绿原酸对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品1.000mg， 置 10 mL量瓶中， 加甲醇定容， 即得 100 μg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取乌苏里瓦韦粉末约 1.00 g，精密加入甲醇 20 mL， 超声处理 30min， 浓缩， 置 10 mL棕色量瓶中， 定容。 用 0.22 μm微孔滤膜过滤， 即为供试品溶液［5］。

2.1.3 绿原酸检测波长的选择 取绿原酸对照品适量， 经紫外全波长扫描， 结果绿原酸在 325 nm波长处有最大吸收。 故以 325 nm为检测波长。

2.1.4 测定绿原酸的色谱条件 参照药典法及文献资料［6-8］， 对 色 谱 条 件 进 行 了 优 化。 Eclipse XDB-II C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（13 ∶87）； 体 积流量 1.0 m L/m in； 进 样量 10 μL； 柱 温25 ℃； 波长 325nm。 按以上条件测定样品中绿原酸量， 理论塔板数不少于7 000。 HPLC色谱图见图 1。

2.1.5 线性关系考察 分别吸取绿原酸含有量为 0.4、0.8、 1.0、 3.0、 4.0 μg的对照品溶液， 依次进样， 测定峰面积。 以色谱峰面积 （mAu） 为横坐标， 进样量 （μg） 为纵坐标， 进行回归分析得： y=0.000 5x+0.171 5， R2= 0.996 4 （n=5）， 说明绿原酸进样量与峰面积在 0.4 ～4 μg范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 精密移取绿原酸对照品 10 μL， 采用“2.1.4” 项色谱条件， 连续进样 5 次， 分别测定峰面积，计算 RSD值为 2.03%。

2.1.7 稳定性试验 取 “2.1.2” 中供试品溶液， 分别在0、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样， 测定峰面积， 计算 RSD值为 2.56%。

图1 对照品 （A） 和供试品 （B） 的 HPLC色谱图

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知绿原酸含有量的乌苏里瓦韦药材粉末 0.500 0 g， 共 6 份， 分别加入一定量的绿原酸对照品， 采用 “2.1.2” 项下操作， 按照 “2.1.4”项色谱条件进样，分别测定峰面积，计算回收率，结果见表1。

表 1 绿原酸加样回收试验结果 （n=6）

2.1.9 重复性试验 分别称取 5 份乌苏里瓦韦药材各1.000 g， 按 “2.1.2” 项方法制备供试品溶液， 分别进样测定绿原酸， 计算 RSD值为 0.76%。

2.1.10 样品测定 精密称取乌苏里瓦韦药材各 1.000 g，5 份， 按 “2.1.2” 项方法制备供试品溶液， 采用 “2.1.4”项色谱条件测定峰面积，根据绿原酸标准曲线 y= 0.000 5x+0.171 5计算， 乌苏里瓦韦中绿原酸平均含有量为 2.635 mg/g。

2.2 叶黄素的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取叶黄素对照品10.000 mg， 用丙酮溶解并定容于 10 mL量瓶中， 摇匀， 得到对照品贮备液 （1 mg/mL）。 将贮备液分别稀释为 1、 10、 25、50、 100 μg/mL。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取2.00 g乌苏里瓦韦粉末， 放入锥形瓶中， 加入 80 mL的丙酮溶液。 70℃恒温提取 30min。 将提取液浓缩后， 定容至 10 mL。 经 0.22 μm滤膜过滤后，即为供试品溶液。

2.2.3 叶黄素检测波长的选择 将叶黄素对照品溶液在200 ～800 nm波长范围内进行扫描， 发现其在 446 nm波长处有最大吸收峰， 故确定检测波长为 446 nm。

2.2.4 测定 叶 黄 素的 色 谱 条 件［9-10］使 用 Agilent Eclipse XDB-IIC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） 色谱柱， 流动相为100%甲醇； 体积流量 1 mL/min； 柱温为室温； 进样量 10 μL； 检测波长 446 nm。 按以上条件测定样品中叶黄素量，理论塔板数不少于3 000。 HPLC色谱图见图 2。

图2 对照品 （A） 及供试品 （B） 色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别吸取 10 μL的 1、 10、 25、 50以及 100 μg/m L的对照品溶液进样， 按 “2.2.4” 项中色谱条件测定色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量（μg） 为横 坐标， 进 行分析， 得线性回 归 方 程： y= 101.10x+221.20 （r=0.999 8）， 叶黄素对照品站在 1 ～100 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取质量浓度为 25 μg/mL的叶黄素对照品溶液连续进样5 次， 每次进样10 μL， 测定峰面积， 其 RSD为 1.9%。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液， 分别于制备后0、 4、 8、 12、 24、 48 h 测定峰面积， 供试品溶液在 2 d 内基本稳定， 峰面积的 RSD为 3.4%。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知叶黄素含量的乌苏里瓦韦药材粉末 1.000 g， 共 6 份， 分别加入一定量的叶黄素对照品， 采用 “2.2.2” 项下操作， 按照 “2.2.4” 项色谱条件进样， 分别测定峰面积，计算回收率， 结果见表2。

表 2 叶黄素加样回收试验结果 （n=6）

2.2.9 重复性试验 精密称取乌苏里瓦韦药材 2.00 g样品， 按 “2.2.2” 项下方法制备， 采用 “2.2.4” 项色谱条件进样 5 次， 测定并计算得到 RSD为 1.30%。

2.2.10 样品测定 精密称取样品乌苏里瓦韦药材 2.00 g，5 份， 按 “2.2.2” 项中的方法制备， 将样品稀释 5 倍， 进样 10 μL， 经测定叶黄素平均含有量为 110 μg/g， RSD为 1.50%。

3 讨论与结论

在绿原酸测定过程中，药典记载的金银花和菊花中绿原酸的定量测定， 波长分别选择为327 nm和340 nm， 通过紫外检测， 绿原酸在 325 nm处有最大吸收。 但在实验过程中， 采用 DAD检测器， 分别对波长 327 nm和 340 nm的结果进行了监测， 结果这 2 个波长与 325 nm的波长， 色谱图相似， 但分离度没有 325 nm好， 故选择 325 nm作为乌苏里瓦韦中绿原酸的检测波长。

在叶黄素测定过程中， 先后采用甲醇-水 （90 ∶10）、甲醇-水 （95 ∶5）、 甲醇-水 （98 ∶2）、 100%甲醇为流动相，结果表明在采用前3种条件做流动相时，其叶黄素保留时间较短， 且叶黄素的分离度不高； 在 100%甲醇为流动相时，分离效果好，操作简便，色谱峰形最佳，保留时间适中，且具有良好的分离度。

选用以上方法测定乌苏里瓦韦中绿原酸和叶黄素，准确、快速，具有较高的准确度和良好的重现性，干扰少。测定结果表明采用 《中国药典》 记载的绿原酸提取方法，提取乌苏里瓦韦中的绿原酸，经测定其绿原酸量较高。乌苏里瓦韦中叶黄素的量比大多数叶类蔬菜中量高［11］。 绿原酸［12-13］和叶黄素［14-15］都有广泛的药理作用， 因此乌苏里瓦韦是一种有很大开发价值的药用植物。

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： B

： 1001-1528（2014）03-0654-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.051

2013-03-12

黑龙江省教育厅课题 （12521529）

王丽红 （1968—） ， 女， 博士生， 教授， 从事植物药的研究与开发利用。 TEL： 13846175975， E-mail： wlh_6663@163.com

*通信作者： 穆立蔷 （1966—） ， 女， 教授， 主要从事植物资源开发利用的研究工作。 E-mail： m lq0417@163.com