基于层次分析法的多指标综合评价优选宣木瓜提取方法

查日维， 谢晓梅， 杨 沫， 周亚菁， 吴 茜， 王 键

（安徽中医药大学药学院， 现代中药安徽省重点实验室， 安徽省 “115” 新安医药研究与开发产业创新团队， 安徽 合肥 230031）

基于层次分析法的多指标综合评价优选宣木瓜提取方法

查日维， 谢晓梅*， 杨 沫， 周亚菁， 吴 茜， 王 键

（安徽中医药大学药学院， 现代中药安徽省重点实验室， 安徽省 “115” 新安医药研究与开发产业创新团队， 安徽 合肥 230031）

目的 优选制备宣木瓜生物活性成分提取物的提取方法。方法 比较渗漉提取法、超声提取法和回流提取法，以齐墩果酸、 熊果酸、 可滴定总有机酸、 总多酚、 总多糖的量以及提取物收率为考察指标， 采用层次分析法 （AHP）确立权重，以多指标综合评分法对提取方法进行评价。结果 3种提取方法所得宣木瓜提取物的收率及各类成分含有量有较大的差异， 最佳提取方法为回流提取法， 一致性检验结果 （CR＜0.1） 表明权重系数合理有效。 结论 基于AHP法的多指标综合评价提取方法具有科学性和准确性， 研究内容可为宣木瓜提取物的制备和质量控制提供参考。

宣木瓜；提取方法；层次分析法；多指标综合评价

宣木瓜，又名皱皮木瓜、铁脚梨，为蔷薇科植物贴梗海棠 Chaenomelesspeciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果实； 是安徽道地药材；有舒筋活络、和胃化湿功效，中医临床用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿［1］。 研究表明， 宣木瓜中富含具有镇痛抗炎作用的有机酸类化合物、增强免疫活性及抗氧化作用的三萜类化合物、对胃肠平滑肌有松弛作用的黄酮类化合物以及具有抗氧化活性作用的多糖类化合物［2-5］。 近年来已有对木瓜提取物的药效研究［6-9］， 但鲜见木瓜提取物提取方法评价的报道。中药提取物是对药材的深度加工，具有技术水平高、产品附加值大， 质量易于控制等优势［10］。 本研究在前期实验的基础上， 采用先用 75%乙醇提取， 残渣再用水提取的方法制备宣木瓜提取物， 通过对提取物中齐墩果酸 （oleanolic acid， OA） 和熊果酸 （ ursolic acid， UA） 、 可滴定总有机酸、总多酚、总多糖四类活性成分的定量测定，比较超声、回流、渗漉3种常用中药提取方法，结合提取物收率，采用 AHP综合评判， 优选宣木瓜最佳提取方法， 以期为宣木瓜提取物的制备、质量控制及后续研究提供科学依据和参考资料。

1 仪器和材料

1.1 仪器 Agilent1260 高 效 液 相 色 谱 仪 （ Agilent公 司）；756MC紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司） ； BP221D电子 天 平 （ Sartorius公 司 ） ； KQ-250DB数 控超声波清洗器 （ 江苏省昆山市超声仪器有限公司） ； Milli-Q实验室超纯水系统 （ Merck Millipore公司） ； pH S-3CT型精密酸度计 （上海大普仪器有限公司）； 电磁搅拌器； HHS型电热恒温水浴锅 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试药 宣木瓜来源于安徽宣城， 经本院彭华胜教授鉴定为贴梗海棠 Chaenomeles sepciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果实； 齐墩果酸 （ 批号为 110709-200505）、 熊果酸 （批号为 110742-200516）、 没食子酸 （批号为 110831-200302） 对照品由中国药品生物制品检定所提供；邻苯二甲酸氢钾为基准物质；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 提取方法 精密称取宣木瓜粗粉 5 g， 采用常规提取条件，按下述方法进行提取试验，各方法平行两份。

2.1.1 超声提取 加 75%乙醇 60 mL于样品中， 浸泡 0.5 h， 室温超声 1 h， 滤过， 滤渣加 60 mL水浸泡 0.5 h， 室温超声1 h， 滤过， 合并滤液， 浓缩， 真空干燥至恒定质量。

2.1.2 回流提取 加 75%乙醇 60mL于样品中， 浸泡 0.5 h， 80 ℃回流 1 h， 滤过， 滤渣加 60mL水浸泡 0.5 h， 100℃回流 1 h， 滤过， 合并滤液， 浓缩， 真空干燥至恒定质量。

2.1.3 渗漉提取 加 75%乙醇 180mL于样品中， 浸泡 24 h， 以 3 mL/min 体积流量渗漉， 滤渣加 180 mL水浸泡 0.5 h， 以 3 mL/min 体积流量渗漉， 合并渗漉液， 浓缩， 真空干燥至恒定质量。

2.2 多指标成分测定方法

2.2.1 HPLC法测定齐墩果酸和熊果酸［11］

2.2.1.1 供试品溶液的制备 分别精密称取 “2.1” 项下提取方法所制得的提取物 0.35 g， 置具塞锥形瓶中， 精密加甲醇 25mL， 密塞， 称定质量， 超声处理 （功率 250 W，频率 40 kHz） 20 min， 放冷， 再称定质量， 用甲醇补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 弃去初滤液， 续滤液过 0.45 μm滤膜，备用。

2.2.1.2 齐墩果酸、 熊果酸对照品溶液的制备 精称齐墩果酸对照品 3.82 mg， 加甲醇溶解， 定容至 10 mL量瓶中，得齐墩果酸贮备液。 精称熊果酸对照品4.34mg， 加甲醇溶解， 定容至10mL量瓶中， 得熊果酸贮备液。 分别精密量取各贮备液适量混合， 得每1 mL含齐墩果酸0.191 mg、 熊果酸 0.217 mg。

2.2.1.3 色谱条件与系统适用性试验 用 Shim-packCLCODS （M） 色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 甲醇-水-冰乙酸-三乙胺 （265 ∶35 ∶0.1 ∶0.05） 为流动相， 体积流量0.6mL/min； 柱 温 20 ℃， 检测 波 长 210 nm， 进样 量 20 μL。 齐墩果酸理论塔板数在16 000以上， 齐墩果酸和熊果酸分离度达 1.6。 3 种提取方法所得提取物的 HPLC谱图见图1。 各提取物中齐墩果酸和熊果酸的量按外标一点法计算。

图1 宣木瓜提取物 HPLC谱图

2.2.2 电位滴定法测定总有机酸［12］

2.2.2.1 供试品溶液的制备 分别精密称取 “2.1” 项下各提取方法所制得的提取物 0.45 g至锥形瓶中， 精密加水30mL， 超声 30 min， 冷却至室温， 称重， 加水补足减失的质量，抽滤，弃去初滤液，续滤液备用。

2.2.2.2 测定方法 精密量取供试品溶液 15 mL， 按电位滴定法 （ 《中国药典》 2010 年版一部附录ⅧA）， 用已标定浓度的 NaOH标准液 （0.056 8 mol/L） 滴定至终点。 利用Origin 6.0 Professional软件绘制滴定曲线， 由二级微商内插法计算滴定终点，以苹果酸计，按下式计算各提取物中可滴定总有机酸量。

式中： C为氢氧化钠标准溶液浓度 （mol/L）， V为计量点时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 （mL）， V0为空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 （m L）， M为苹果酸摩尔质量（g/mol）， W为提取物质量 （g）。

2.2.3 福林-酚比色法测定总多酚

2.2.3.1 供试品溶液的制备 分别精密称取 “2.1” 项下提取方法所制得的提取物 0.15 g， 至锥形瓶中， 精密加水30mL， 放置过夜， 超声 10 min， 滤过， 弃去初滤液， 续滤液备用。

2.2.3.2 没食子酸对照品溶液的制备 精称没食子酸对照品适量，置棕色量瓶中，加水溶解、稀释至刻度，得每1 m L含没食子酸 0.322 mg。

2.2.3.3 测定方法 按 《中国药典》 2010 年版一部附录ⅩB总酚测定法， 精密量取供试品溶液2mL至25 mL量瓶中， 加磷钼钨酸 1.0mL、 水 10.0mL， 用 7.5%Na2CO3定容至 25mL， 暗处放置 3 h， 照紫外-可见分光光度法 （ 附录ⅤA）， 在 400 ～800 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱，于最大吸收波长 763 nm处测定各样品吸光度， 利用标准曲线法计算各提取物中总多酚的量。

2.2.3.4 标准曲线的绘制 分别精密量取没食子酸对照品溶液 0.030、 0.070、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至 25 mL量瓶中， 加磷钼钨酸 1.0 mL， 再加水至 13 mL， 用 7.5% Na2CO3定容至刻度， 暗处放置 3 h， 以相应试剂溶液为空白， 在 763 nm 处 测 定 吸 光 度。 得 到 回 归 方 程 为 Y= 114.85X+0.103 1， r=0.999 5， 没食子酸在 0.386 ～12.9 μg/mL质量浓度范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.4 硫酸-苯酚法测定总多糖［13］

2.2.4.1 供试品溶液的制备 分别精密称取 “2.1” 项下提取方法所制得的提取物 0.45 g， 至锥形瓶中， 精密加水30 mL， 超声 30 min， 冷却至室温， 称重， 加水补足减失的质量， 抽滤， 弃去初滤液， 精密量取续滤液 2 mL至 10 mL离心管中， 加无水乙醇 8mL； 离心 （4 000 r/min） 1 h， 弃去上清液， 沉淀加水溶解， 定容至25mL量瓶中， 备用。

2.2.4.2 葡萄糖对照品溶液的制备 精称葡萄糖对照品适量， 置量瓶中， 加水溶解、稀释至刻度， 得每1 mL含葡萄糖0.099 2 mg。

2.2.4.3 测定方法 精密量取供试品溶液 1 mL至具塞试管， 加 5%苯酚 1.0 mL， 混匀； 加浓硫酸 6.0 mL， 立即摇匀； 沸水浴加热 10min， 冷却至室温； 照紫外-可见分光光度法 （附录ⅤA） 在 400 ～800 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱， 于最大吸收波长 485 nm处测各样品吸光度， 利用标准曲线法计算各提取物中总多糖的量。

2.2.4.4 标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖对照品溶液0.10、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至具塞试管中， 加水至1.0 mL， 加 5%苯酚 1.0 m L混匀， 加浓硫酸 6.0 mL， 立即摇匀， 沸水浴 10min， 冷却至室温， 以相应试剂溶液为空白， 在 485 nm处测吸光度。 得回归方程 Y=4.260 8X+ 0.114 1， r=0.999 4， 葡萄糖在 9.92 ～99.20 μg/mL质量浓度范围内与吸光度线性关系良好。

2.3 AHP法确定多指标权重系数 层次分析法 （ Analytical Hierarchy Process， AHP）［14］是 将评价目标分 为 若 干层次和若干指标，依照不同权重进行综合评价的方法。本研究将评价体系设计为三层， 如图2。 引入九分位的相对重要的比例标度［15］， 由评估主体确定各指标的相对重要性， 并将结果形成判断矩阵，结果见表1。

图2 宣木瓜最佳提取方法层次结构模型

表1 宣木瓜提取方法优选指标层的矩阵

使用AHP分析软件进行具体计算， 求得齐墩果酸和熊果酸、总有机酸、总多酚及总多糖各指标权重系数为：0.564、 0.263、 0.118 和 0.055。 随机一致性比率 CR=CI/ RI， 当 CR＜0.1 时， 判断矩阵具有满意的一致性及权重计算正确性。 本次试验的一致性比率为 CR=0.043 ＜0.1， 表明权重计算正确。

2.4 结果

2.4.1 提取物得率 按 “2.1” 项下不同提取方法制备提取物， 得率见表2。

表2 不同提取方法所得提取物的得率

2.4.2 多指标成分测定结果 按 “2.2” 项下测定方法对提取物进行分析检测，相同测定平行两次，以平均值表示；并采用 AHP法确定的权重系数进行综合评价， 结果见表3。

3 结论与讨论

3.1 最佳提取方法的确立 从表 3 中可以看出提取物中可滴定总有机酸、总多酚含有量高低顺序为：回流法＞超声法＞渗漉法； 总多糖含有量高低顺序为： 回流法 ＞渗漉法＞超声法；齐墩果酸和熊果酸总含有量高低顺序为：超声法 ＞回流法 ＞渗漉法。 基于 AHP的综合评分法得到的评分高低顺序为： 回流法＞超声法＞渗漉法。 由表2可见，3种不同的提取方法提取物得率顺序为：回流法＞渗漉法＞超声法；由此确立宣木瓜的最佳提取方法为回流提取法。

表3 宣木瓜不同提取方法的综合评价

3.2 提取溶剂的选择 在宣木瓜提取物的制备中， 兼顾传统中药的提取溶剂， 参考 《中国药典》 2010 年版一部关于中药成方制剂制备中的饮片提取工艺，在前期实验的基础上， 建立先用 75%乙醇提取， 再用水提取的工艺流程， 以期最大程度保持宣木瓜水溶性和脂溶性有效成分的整体性。

3.3 本实验对各指标成分的定量测定方法均采用文献报道的成熟方法，其方法学考察同文献报道。在提取物考察指标的选择上，结合对宣木瓜传统的评价标准 “以味酸者为佳” 以及 《中国药典》 2010 年版一部木瓜质量标准含量测定指标成分，选择齐墩果酸和熊果酸、总有机酸为考察指标；并综合考虑宣木瓜中酚酸类和黄酮类化合物药效学活性及多糖的活性，增加总多酚和多糖作为共同的考察指标。

［ 1 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典： 2010 年版一部［S］.北京： 中国医药科技出版社， 2010： 57.

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）03-0643-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.047

2013-04-12

国家十二五科技支撑计划 （2011BAI04B06） ； 安徽高校省级自然科学研究项目 （ KJ2012A188）

查日维 （1989—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 中药质量分析。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： 351772334@qq.com

*通信作者： 谢晓梅， 女， 教授， 硕士生导师。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： xiexiaomei9401@sina.com