响应面法筛选杜仲的盐制工艺

邓 翀， 宋小妹， 董媛媛， 张亚强

（陕西中医学院， 陕西 咸阳 712046）

响应面法筛选杜仲的盐制工艺

邓 翀， 宋小妹， 董媛媛， 张亚强

（陕西中医学院， 陕西 咸阳 712046）

目的 以多指标结合响应面设计筛选杜仲盐制工艺。方法 以总黄酮、总木脂素、总多糖、出膏率为评价指标， 采用多指标综合评分结合 Box-Behnken 响应面设计考察不同烘制时间、 烘制温度、 加盐量对杜仲中各化学成分的影响； 经统计分析， 筛选杜仲盐制工艺。 结果 响应面回归方程预测并优选杜仲的盐制工艺为烘制温度 140 ℃， 烘制时间 35 min， 每 100 g药材加盐量 5 g。 结论 Box-Behnken 响应面设计结合多指标综合评分优选杜仲盐制工艺， 从化学成分整体角度出发，优选的工艺更具有科学性和合理性，为杜仲盐制工艺的建立提供参考。

杜仲； 盐制； Box-Behnken 试验设计； 综合评分

杜 仲 为 杜 仲 科 植 物 Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，具有补肝肾、强骨、益腰膝等功效。其化学成分包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、 多糖及多种氨基酸等化学成分［1］。历代应用均强调炮制后入药，传统炮制方法炙、炒是为了 “断丝”， 以利于调配、 煎煮和粉碎； 盐炙引药入肾，直达下焦，温而不燥，补肝肾、强筋骨、 安胎作用增强［2］。 查阅文献发现盐制杜仲的炮制工艺参数差别较大且缺乏科学全面的评价标准，有必要对盐制杜仲炮制工艺系统研究，规范杜仲盐制工艺。 本实验采用 Box-Behnken 响应面设计结合多指标综合评分筛选杜仲的盐制工艺参数，旨在为规范盐制杜仲饮片规格和盐制饮片临床应用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 试药 杜仲药材 （略阳县嘉木杜仲产业有限公司）； 芦丁 （0080-9705）、 松脂醇二葡萄糖苷（ 111537-200502 ） 、 D-无 水 葡 萄 糖 （ 110833-200503）对照品均来自中国药品生物制品检定所（均供含量测定用）； 水为纯净水； 其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 UV1102 紫外分光光度计 （上海天美仪器有限公司）； FA2004N电子分析天平 （上海天美仪器有限司）；HH-2 型电热恒温水浴锅 （北京科伟永兴仪器有限公司）； CS1012A型电热鼓风干燥箱（中国重庆银河试验仪器有限公司）； SHB-III型循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）。

2 方法

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 各对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁对照品 约 14.5 mg， 松 脂 醇 二 葡 萄 糖 苷对 照 品4.43 mg， D-无水葡萄糖对照品 17 mg， 前两者以无水乙醇溶解，葡萄糖以纯净水溶解，分别定容于25 mL量瓶中。

2.1.2 供试液的制备 精密称取炮制品粉末约1 g，用30 mL 70%的乙醇回流两次， 每次1 h，过滤， 合并滤液于80 ℃水浴蒸干， 用70%乙醇溶解，定容于25 mL量瓶中， 于 4 ℃冷藏待测 （出膏率、总黄酮、 总木脂素的测定）［3-4］。

精密称取炮制品粉末 （过 60 目筛） 约 2 g，以 10 倍量 80%的乙醇回流 1 次， 每次 1 h， 滤渣用 10 倍量80%的乙醇洗涤 2 次； 滤渣以 6 倍量纯净水85℃水浴回流2 次， 每次 1 h，过滤， 滤渣和烧瓶用10 mL热水洗涤 2 次，每次 5 mL，将过滤液于25 m L量瓶中， 用纯净水定容， 即得各供试品溶液 （适用于多糖的测定）［5］。

2.2 评价指标测定方法建立

2.2.1 出膏率的测定方法 取提取液 5mL置于已恒重的蒸发皿中80 ℃水浴蒸干， 于105 ℃恒重4 h后，放置干燥器中至室温时称其质量，用其质量减去原蒸发皿的质量，即为5 mL提取液的膏重， 计算出膏率。

2.2.2 总黄酮测定方法 取芦丁对照品溶液各1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0 mL于 25 m L量瓶中，各加水至 6 mL，加 5%的亚硝酸钠溶液 0.2 mL，摇匀， 静置 6 min； 加 10%的硝酸铝溶液 0.2 mL摇匀， 静置 6 min； 加 10%的氢氧化钠溶液 4 mL，摇匀， 用纯净水定容至 25 mL， 以纯净水做空白，于 510 nm处测其吸光度［6］。 以吸光度 （A） 为纵坐标， 质量浓度 （C） 为横坐标绘制标准曲线，结果为 A=8.586 2C+0.030 2， r=0.999 9， 表明芦丁在 0.023 2 ～0.069 6 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

分别考察总黄酮测定方法的精密度、样品稳定性、重复性、回收率等项，符合方法学考察要求［4］。

2.2.3 总木脂素测定方法 取松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液各 0.3、 0.5、 0.7、 0.9、 1.1 mL于 10 m L试管中， 依次加入 10%的变色酸液 1 m L， 摇匀， 加3 m L浓硫酸， 用纯净水定容至 10 mL， 沸水浴 30 min， 流水冷却， 于 571 nm处测其吸光度，以纯净水做空白［7］。以吸光度 （A） 为纵坐标，质量浓度 （C） 为横坐标绘制标准曲线， 结果为 A= 34.009C+0.0441， r=0.999 5， 表明松脂醇二葡萄糖苷在5.316 ～19.492 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

分别考察总木脂素测定方法的精密度、样品稳定性、重复性、回收率等项，符合方法学考察要求［3］。

2.2.4 总多糖的测定方法 取 D-无水葡萄糖对照品溶液各 0.25、 0.3、 0.4、 0.45、 0.5 mL于 10 m L试管中， 各加水至2 mL起， 加 5%的苯酚溶液（现用现配）1 mL， 摇匀， 迅速加入浓硫酸 5 mL，用纯净水定容至10 mL试管中， 用玻璃棒搅匀后置80 ℃水浴 20 min， 取出冰水浴 5 min［5］， 以纯净水做空白， 于 480 nm处测其吸光度。 以吸光度 （A）为纵坐标， 质量浓度 （C）为横坐标绘制标准曲线， 结果为 Y=24.34C-0.144 7， r=0.999 2。 表明 D-无水葡萄糖在 0.017 ～0.034 mg/m L范围内与吸光度呈良好线性关系。

分别考察多糖测定方法的精密度、样品稳定性、重复性、回收率等项，符合方法学考察要求。

2.3 多指标综合评分方法建立 以总黄酮、 总木脂素、总多糖、出膏率综合评分为考察指标，评分标准为： 满分为 1， 总黄酮权重系数为 0.3、 总木脂素权重系数为 0.3、 总多糖权重系数为 0.2； 出膏率权重系数为 0.2。 综合评分 （A） =测定总黄酮量/测定总黄酮最大值 ×0.3+测定总木脂素量/测定总木脂素最大值 ×0.3+测定总多糖量/测定总多糖最大值 ×0.2+出膏率值/最大出膏率值 ×0.2。

2.4 烘制工艺研究方案 参考文献［8-11］， 选择杜仲炮制工艺考察因素为烘制温度、烘制时间、加盐量。 采用 Design Expert8.05 软件的 Box-Behnken设计方法设计实验方案。试验因素水平设计见表1， 共设计 17 组烘制实验点。

表 1 Box-Behnken试验设计考察因素与水平编码Tab.1 Factors and levels Box-Behnken RSM test

3 结果

3.1 回归模型的建立及显著性检验

3.1.1 盐制工艺综合评分回归模型的建立 Box-Behnken 实验设计和所测成分含有量综合评分数据见表 2。 采用 Design Expert8.05 软件对表 2 中各组综合评分数据进行多元回归和二项式分析，建立杜仲盐制工艺综合评分 （Y） 对 3 个因素 （X1、 X2、X3） 的二次回归模型方程为 Y=0.77-0.065 × X1+0.002567 ×X2+0.055 ×X3-0.077 ×X1× X2-0.093 ×X1×X3+0.036 ×X2×X3-0.061 ×-0.078 ×+0.002514 ×。

表 2 综合评分的 Box-Behnken试验设计与结果Tab.2 Design and results for response surface analysis

3.1.2 方程的显著性检验 对综合评分 （A） 对 3个因素的回归模型进行方差分析，结果见表3。方差分析表明，模型的 F=7.15 （P=0.0084，P＜0.01）， 实验结果误差较小， 模型的失拟项 F= 1.76 （P=0.2931， P＞0.05）， 说明失拟项误差对模型没有显著性影响，模型拟合合理。对实验结果影响显著分别是一次项 X1，交互项 X2X3， 二次项表 明 考 察 因 素 对 综 合 评 分 的 影 响 不仅存在线性关系，还有交互综合影响。模型的相关系数平方为 0.901 9， 表 明该模型比较准确 地体现盐制杜仲化学成分综合评分与烘制温度、烘制时间和加盐量的关联，可以采用该回归方程对杜仲盐制工艺进行分析与预测。

表3 提取回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis for the regression m odel established

3.2 最佳工艺条件预测 通过回归模型方程的预测， 得出杜仲盐制工艺条件为烘制温度 140.03 ℃，烘制时间 35.57 min，每 100 g药材加盐量 4.96 g。考虑到实际的工业化生产操作，将提取工艺参数修正为烘制温度为 140 ℃， 时间 35min， 每 100 g药材加盐量5 g。

3.3 试验验证 采用筛选的工艺参数烘制杜仲进行5次平行试验，采用工艺筛选中各指标所测最大值为参照，把验证试验各指标实测值带入综合评分计算公式，结果发现5次实测综合评分平均值为0.822 1， 预测综合评分值为 0.837 7， 两者标准偏差为1.862%。验证综合评分值与理论预测值吻合程度良好。

4 讨论

4.1 文献报道杜仲盐制烘制工艺多以多糖、 总木脂素为评价标准进行研究，本实验以多指标综合评分为指标，从整体角度反映烘制因素差异导致化学组分变化，能够更客观、科学的评价杜仲盐制工艺。在文献查阅的基础上，本实验选择烘制温度、烘制时间和加盐量为考察因素， 采用 Box-Behnken响应面设计筛选盐制杜仲的烘制工艺，筛选出的烘制工艺为烘制温度 140.03 ℃， 烘制时间 35.57 min，每 100 g药材加盐量 4.96 g。

4.2 目前关于盐制工艺研究报道主要通过正交实验设计［8-11］， 而正交试验存在只能给出因素水平组合，无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。本实验采用响应面分析法，将考察因素与实验结果的关系用多项式拟合，建立考察因素与实验结果的关系函数模型，可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化，最终筛选和预测最佳的工艺参数。

［ 1 ］ 王亚琴， 张康健.杜仲次生代谢物的研究进展［J］.中草药， 2004， 35（7）： 836-839.

［ 2］ 龚千峰.中药炮制学［M］.北京： 中国中医药出版社，2007： 206.

［3］ 邓 翀，颜永刚，杨乖利，等.正交实验设计优化杜仲总木脂素提取工艺 ［ J］.中国中医 药信息 杂志， 2011， 18（8）， 45-46.

［4］ 邓 翀，冯改利，杨乖利，等.正交实验设计优化杜仲总黄酮提取工艺［J］.中华中医药杂志， 2011， 26 （11），2695-2697.

［5］ 刘军海，任惠兰，段玉兰，等.杜仲叶多糖提取工艺研究［J］.食品科学， 2007， 28（7）： 264-267.

［6］ 侯 惺，吕志强，赵才政，等.盐炙与配伍对杜仲丸的3种药效部位含量的比较分析［J］.中成药， 2010， 32（8）：1442-1443.

［7］ 卢 曦，李 军，蒋向军，等.黑老虎总木脂素含量测定［J］.安徽农业科学， 201139（20）： 12152-12153

［8］ 张 萍，张南平，林瑞超.多指标正交试验法优选杜仲药材最佳炮制工艺［ J］.药物分析杂志， 2009， 29 （11）：1817-1820.

［9］ 宋莎莎，张亚强， 崔九成.正交实验探讨烘法炮制杜仲［J］.陕西中医学院学报， 2009， 32（1）： 70-71.

［10］ 宋 嬿， 朱俊杰， 罗 书.杜仲的炮制工艺研究［J］.中成药， 2008， 30（6）： 879-882..

［11］ 张 英， 张卫强， 王淑敏.盐制杜仲的炮制工艺研究［ J］.长春中医药大学学报， 2007， 23（3）： 21-22.

Response surfacemethod for salt-water processing Eucommia ulmoides

DENG Chong， SONG Xiao-mei， DONG Yuan-yuan， ZHANG Ya-qiang
（ShaanxiUniversity of ChineseMedicine， Xianyang 712046， China ）

Eucommia ulmoides； salt-water processing； Box-Behnken experiment design；comprehensive evaluation

R283

： A

： 1001-1528（2014）03-0585-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.030

2013-05-15

陕西省自然科学基金项目 （2010JQ4022）； 陕西省教育厅自然科学专项 （2010JK501）

邓 翀 （1978—）， 博士， 副教授， 研究方向： 中药炮制化学及炮制原理。 Tel： （029） 38185165， E-mail： fmmudz217@126.com