王少敏, 陆继伟, 孟 莉, 季 申
(上海市食品药品检验所, 上海201203)
顶空进样 GC/MS法研究干漆中的挥发性毒性成分
王少敏, 陆继伟, 孟 莉, 季 申
(上海市食品药品检验所, 上海201203)
目的 对干漆药材的挥发性毒性成分进行研究。 方法 采用顶空进样气相质谱联用 (GC/MS) 技术对干漆药材样品和饮片进行分析,研究其中的挥发性毒性物质。结果 共鉴定出了二甲苯、三甲基苯、甲基苯甲醛类同分异构体和乙酸至庚酸等系列有机酸类化合物等25个毒性成分。 结论 对炮制后的干漆色谱图中虽然仍有二甲苯类和甲基苯甲醛类物质的色谱峰,但峰强度明显降低,证明炮制后毒性明显减弱。
GC/MS 法; 干漆; 挥发性毒性成分
干漆是漆树科植物漆树 Toxicodendron vernicifluum (Stokes) F.A.Barkl.的树脂生漆经加工后的干燥品,有破瘀通经、消积杀虫的功效,主要用于瘀血闭经、 癥瘕积聚、 虫积腹痛等病症[1], 现代临床也有将干漆与其他药材组成复方用于治疗冠心病 和 癌 症 辅 助 治 疗[2-5], 干 漆 在 临 床 应 用 愈 来愈多。
干漆有毒,临床使用前均需对干漆进行烧制以降低 毒 性[6-8]。 目 前 对 生 漆 的 成 分 已 有 较 多 研究[9-11],主要成分为漆酚、漆酶、 漆树多糖、 含氮物、树胶质和水分等,但对干漆及炮制后干漆饮片的成分研究较少,仅认为干漆是生漆中的漆酚在虫漆酶的作用下,在空气中氧化生成的黑色树脂状物质[12], 对干漆毒性成分研究未见报道。
干漆具有强烈漆臭,有较强毒性,且易致人发生严重过敏,炮制后的干漆毒性明显减弱,仅有轻微臭味,故推测此类有明显臭味的挥发性物质可能是干漆的毒性成分。 本实验采用气相色谱/质谱联用技术 (GC/MS) 对干漆及干漆炮制品中挥发性的毒性成分物质基础进行研究,以期明确该药材的毒性成分基础,并为进一步的质量标准和临床用药安全控制提供支持。
美国安捷伦公司 Agilent6890NGC/5973N MSD气 相 质 谱 联 用 色 谱 仪; MSD Chemistation D 03.00.611 数据处理系统。
乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯等标准物质均购自上海化学试剂研究所,色谱标准。
干漆及相应批号的炮制品 (批号为1994090205、1998070603、 1999060208、 1999100512) 由上海华宇药业有限公司提供,并由上海中医药大学崔亚君副教授鉴定。
2.1 对照品的制备 精密量取乙苯、 对二甲苯、邻二甲苯和间二甲苯对照品各5 μL, 分别置20mL顶空进样瓶中,密封,即得。
2.2 供试品的制备 取干漆粉末 (过二号筛) 约0.5 g, 精密称定, 置 20 m L顶空进样瓶中, 密封,即得。
Agilent FFAP毛细管色谱柱 (30 m×0.25 mm,0.25 μm); 升温程序为初始温度 50 ℃, 保持2 min, 以 5 ℃ /min 的 速率升温至 250 ℃ 并 保 持3 min; 载气为氦气, 体积流量 1.0 mL/min; 顶空进样; 进样口温度 280 ℃; 气质接口温度 250 ℃;电离方式为电子轰击 (EI); 电离能量 70 eV; 扫描质量范围 30 ~500 AMU; 扫描间隔 0.5 s。
取对照品和供试品顶空进样瓶中在110 ℃加热15 min; 顶空进样注入气相质谱联用色谱仪, 测定,即得。
5.1 挥发性物质结构确认 对 4 批干漆样品进行检测,结果4批干漆样品得到的总离子流图相似,检出色谱峰个数一致,仅离子流强度有所不同。扣除相应的随行空白中的干扰峰,共检出 25 个色谱峰, 见图 1。 对此 25 个峰进行质谱扫描后得到质谱图, 经与 Nist数据库, 此 25 个峰全部得到鉴定,包括:乙苯和二甲苯等6个同分异构体、苯乙酮和甲基苯甲醛等4个同分异构体,三甲基苯类3个同分异构体、丙基甲苯类4个同分异构体、乙酸至庚酸等 6 个有机酸类化合物、萘及 α-甲基苯甲醇,见表1。
图1 干漆药材总离子流图Fig.1 GC/MS ion chromatograms of Toxicodendri Resina
其中质谱峰编号分别为3、 4、 5、12、 13 对应的化合物为同分异构体, 分子式均为 C8H10, 质谱图显示其应为邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯或其立体异构体质谱图, 见图 2。 为进一步确认峰归属,采用邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯对照品分别进样,经过保留时间确定3、 4、 5 号峰分别为对二甲苯、 间二甲苯、 邻二甲苯, 12、 13 号峰分别为间二甲苯和邻二甲苯的立体异构体。
表1 干漆药材挥发性毒性成分Tab.1 Volatile toxic com pounds in Toxicodendri Resina
续表1
图 2 二甲苯类同分异构体的 GC/MS质谱裂片图 (化合物 2、 3、 4、 12、 13)Fig.2 GC/MS fractu re ion ch romatogram of structural isomers of Xylene( com pound 2、 3、 4、 12、13)
5.2 干漆毒性成分确认 4 批干漆药材的气质联用总离子流图中二甲苯类物质色谱峰离子流强度最大,其次为甲基苯甲醛类物质,两类物质相对含有量大于 90%。 对炮制后的干漆样品进行检测, 并与干漆药材的气质联用总离子流图进行比对,结果炮制后的干漆得到的总离子流图中色谱峰明显减少,色谱峰的离子流强度也明显减弱,仅有二甲苯类物质和甲基苯甲醛类物质较为明显,其余物质的色谱峰基本消失, 见图1B。
质谱解析研究表明,干漆药材的挥发性成分主要包括有二甲苯类、三甲基苯类、苯乙酮、丙基甲苯类、甲基苯甲醛类等多种苯环上氢被烷基取代的衍生物和有机酸类化合物。根据文献报道,这些物质对人体均有一定的毒性危害,对眼、黏膜和上呼吸道、皮肤有刺激性,接触后可引起头痛、头晕、恶心、麻醉等,及引起中枢神经和肝肾等多器官损伤,重者可有躁动、抽搐或昏迷,有的有癔病样发作。其中二甲苯类物质长期吸入还能导致再生障碍性贫血,并出现神经衰弱样症状,导致胎儿的先天性缺陷[13-14]。 由于炮制后的干漆饮片与干漆药材相比,毒性下降,故这些挥发性物质应是干漆药材的重要毒性成分。炮制后的干漆色谱图中虽然仍有二甲苯类和甲基苯甲醛类物质的色谱峰,但峰强度明显降低,证明了干漆经过炮制后毒性明显减弱。
6.1 曾用有机溶剂对干漆药材进行提取, 以溶液法进样,以获得非挥发性和挥发性毒性成分的全面信息。先后考察了乙醇、甲苯、正己烷、乙酸乙酯等溶剂,但在实验中发现供试品溶液不稳定,随着光照和加热,溶液颜色变深,供试品溶液色谱图无法重现。考虑到干漆药材本身为干透后的树脂,其较为黏厚的特殊结构使得药材的外表面可能阻断了外界空气中氧气对内部物质的氧化,而将其溶解在溶剂中后可能增加了氧化的速度,致使供试品溶液极为不稳定。采用顶空进样法,经过反复试验,结果可以得到重复、稳定的供试品色谱图,故最终选择了顶空进样法。
6.2 考察了 DB-5、 DB-17、INNOWAX和 FFAP 4种不同极性范围的毛细管气相色谱柱, 结果 DB-5和 DB-17 色谱柱得到的供试品色谱图中仅有 2 ~3个色谱峰,而 INNOWAX和 FFAP得到的供试品溶液的色谱峰较多, 显示较多信息,且 FFAP色谱柱得到的色谱峰分离度最好, 故选择 FFAP色谱柱作为研究用色谱柱。
6.3 对升温程序进行了优化: ① 起始 50 ℃,10 ℃ /min升至 220 ℃, 保持 3 min;②起始 50 ℃,5 ℃ /min 升至 120 ℃; ③起始 50 ℃, 3 ℃ /min 升至80 ℃, 10 ℃ /min 升 至 200 ℃, 保 持 5 min,20 ℃ /min升至 250 ℃, 保持 5min; ④起始 50℃, 3℃ /min 升 至 60 ℃,保 持 5 min, 15 ℃ /min 升 至120 ℃, 保持 5 min; 20 ℃ /min 升至 250 ℃, 保持3 min; ⑤起始 50 ℃, 保持 2 min, 5 ℃ /min 升至250 ℃,保持3 min。 结果表明升温程序⑤的条件下达到最好的分离度。
6.4 考察了 0.2 g、 0.5 g、 1.0 g 3 种取样量, 结果取样 0.2 g得到的供试品色谱峰数目较少, 而取样0.5 g和 1.0 g得到的供试品色谱峰数目明显增加, 且基本一致, 因取样量为 1.0 g时,色谱峰变宽, 影响分离度, 故确定取样量为 0.5 g。
6.5 考察了 80 ℃、 110 ℃、 135 ℃、 165 ℃ 4 种顶空瓶加热温度, 结果80℃加热后得到的供试品色谱峰数目明显较少, 而110 ℃、135 ℃、165 ℃3 种温度得到的供试品色谱峰数目与色谱峰强度基本一致。 将顶空瓶加热温度设定为 110 ℃, 考察 10 min、15 min 和 25 min 3 种 不同加热时 间,结果加热 10 min 得到的供试品色谱峰数目较少,色谱峰强度较低, 而加热 15 min 和 25 min 得到的数目供试品溶液中色谱峰数目和色谱峰强度基本一致。故确定顶空瓶加热方式为:110 ℃加热 15 min。
6.6 气相色谱质谱联用技术具备分析速度快、 高灵敏度、全谱记录、谱库数据全等特点,可以提供准确的质量数、碎片信息和可能结构,对于未知化合物的鉴定是强有力的工具。本实验采用气相色谱质谱联用技术,通过比较干漆药材和炮制后的干漆饮片离子流图中的色谱峰个数和强度,对干漆有毒挥发性成分进行了确认,并利用对照品和气质谱库对化合物进行了准确的定性,首次对干漆的毒性物质基础进行了研究,也为其他药材毒性物质基础的研究提供了一种思路。
[ 1 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典: 2010 年版一部[S].北京: 中国医药科技出版社, 2010: 15.
[ 2 ] 金莲花.中药干漆的药理作用及临床应用[J].现代医药卫生, 2007, 23(16): 2467-2468.
[ 3 ] 许芍芳, 许静亚, 谭宫屏.干漆治冠心病的实验研究[J].中国生漆, 2002, 22(1): 5-6.
[ 4 ] 程嘉艺, 阎醒予, 刘守义.平消片主要药效学研究[J].中成药, 2008, 30(3): 350-352.
[5] 方建龙,赵安兰,朱智斌,等.平消胶囊治疗晚期恶性肿瘤278 例临床观察[J].现代肿瘤医学, 2003, 11 (4):309-310.
[ 6 ] 李映丽, 吕居娴, 牛晓峰.干漆的生药学研究[J].中国生漆, 1988, 7(2): 1-4.
[ 7 ] 范治忠.生干漆的炮制与 药用 [ J].中国生漆, 1990, 9(3): 42-45.
[ 8 ] 吕桂月.中药干漆炮制工艺改进[ J].中成药, 1990, 12(4): 45.
[ 9 ] 王忠华, 吴采樱.生漆挥发物的初步研究[J].中国生漆,1990, 9(1): 23-25.
[10] 赵 猛, 魏朔南, 胡正海.生干漆及煅干漆的生药学研究[J].中草药, 2010, 41(12): 2089-2092.
[11] 李 林, 魏朔南.生漆漆酚类化合物的 HPLC-ESI-MSn 分析[J].中草药, 2008, 39(12): 1786-1787.
[12] 赵 猛, 魏朔南, 胡正海, 等.干漆及其原植物漆树的研究概况 [J].中草药, 2010, 3(12): 13-18.
[13] 穆进军, 扬 勇, 麻日升.急性甲苯、 二甲苯中毒 86 例临床分析 [J].中国工业医学杂志, 1990, 12(3): 33-34.
[14] 任继坤.急性二甲苯中毒患者的病情观察及护理[J].中华护理杂志, 1994, 41(8): 464-465.
Volatile toxic constituents of Toxicodendri Resina by headspace GC/MS
WANG Shao-min, LU Ji-wei, MENG Li, JIShen
(Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China)
AIM To study the violatile toxic constituents in Toxicodendri Resina.METHODS The headspace GC/MS technique was applied to isolating volatile toxic constituents in Toxicodendri Resina and its decoction pieces.RESULTS Twenty-five volatile compounds from Toxicodendri Resina were isolated and identified including structural isomers of xylene, trimethyl-benzene,methyl-benzaldehyde and serious organic acids.CONCLUSION Processed ToxicodendriResina remains fingerprint peaks of xylene andmethyl-benzaldehyde, but their intensity decreases, which showes the processing can markedly attenuate the toxicity of Toxicodendri Resina
GC/MS; Toxicodendri Resina; volatile toxic constituents
R284.1
: A
: 1001-1528(2014)03-0567-05
10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.026
2013-05-06
王少 敏 ( 1978—), 女, 硕 士, 主 管 药 师, 主 要 从 事 中 药 质 量 控 制 研 究。 Tel: ( 021 ) 38839900-26107, E-mail: wangshaomin2008@163.com