金钱白花蛇商品药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

许 靖， 王成芳， 杜树山， 孟繁蕴， 李 峰*

（1.辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600； 2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室， 北京 100875）

金钱白花蛇商品药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

许 靖1， 王成芳2， 杜树山2， 孟繁蕴2， 李 峰1*

（1.辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600； 2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室， 北京 100875）

目的 建立 10 批金钱白花蛇药材的毛细管电泳指纹图谱。 方法 超纯水超声提取， 以 50 mmol/L硼砂 -200 mmol/L硼酸 （pH8.64） 作为背景电解质缓冲液， 分析在 Beckman P/ACE System MDQ高效毛细管电泳仪上进行， 柱温 25 ℃， 分离电压 20 kV， 检测波长 245 nm， 20 min 完全分离。 结果 建立的指纹图谱有 9 个共有峰， 且方法学考察达到标准。 结论 金钱白花蛇 HPCE指纹图谱与蕲蛇和乌梢蛇有明显差别。

金钱白花蛇；毛细管电泳；指纹图谱

金钱白花蛇 Bungarus Parvus为眼镜蛇科动物银环蛇 Bungarus multicinctus Blyth 的 幼 蛇 干 燥 体。具有祛风、通络、止痉的功效，临床上常用于治疗风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼斜、半身不遂、抽搐痉挛、 破伤风、 麻 风、疥廯［1］。 本课 题组已经对金钱白花蛇核苷、蛋白质、多胺等类成分的分析，也有报道利用分子生物学技术，对金钱白花蛇进行鉴别［2-4］， 但关于毛 细管电泳指纹图谱 的研究未见报道。 本实验采用高效毛细管电泳法对 11批金钱白花蛇商品药材进行了指纹图谱研究及方法学考察，以期对金钱白花蛇商品药材的品种鉴定提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Beckman P/ACE System MDQ高效毛细管电泳仪 （美国贝克曼库尔特公司）； DAD检测器；32Karat色谱工作 站。 未涂层石英 毛 细 管柱 （50 μm×65 cm， 郑州应诺高科有限公司）； AG204 电子分析天平 （METTLER TOLEDO公司）； KQ-250DB型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；LG16 型高速离心机 （北京雷勃尔公司）； SevenmultipH计 （METTLER TOLEDO公司）。

1.2 试剂 尿苷 （中国药品生物制品检定所， 批号 887-200001）； 所用试剂均为市售分析纯，水为超纯水； 所用试剂均通过 0.22 μm微孔滤膜滤过。

1.3 实验材料 金钱白花蛇商品药材为购于不同地区的商品药材， 经李峰教授鉴定， 详见表1。

表1 金钱白花蛇药材商品来源及采购地区Tab.1 Sam p les of Bungarus Parvus

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备［5］取尿苷对照品适量，精密称定， 加水制成每 1 mL含 0.05 mg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备［6］取 50 ℃恒温干燥的各金钱白花蛇样品粉末 （ 过 100 目筛） 约 0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入超纯水10 mL， 密塞，超声处理 30 min，离心 10 min （3000 r/min）， 取上清液过 0.22 μm微孔滤膜， 取续滤液作为供试品溶液。

2.3 电泳条件 毛细管柱 （55 cm×50 μm）， 分离电压 20 kV， 柱温 25 ℃，背 景电解 质为 50 mmol/L硼砂 -0.2 mol/L硼酸 （pH8.6）， 检测波长 245 nm， 以 30 mbar×5s压力进样。 新毛细管柱以 1 mol/LNaOH冲洗 30 min 活化，每次进样前，分别 用 1 mol/L NaOH、水、缓 冲 液 运 行 冲 洗5 min［7］。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 将 9#供试品溶液连续进样 5次，测得指纹图谱，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积 RSD分别小于 0.65%和 4.96%， 表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 新制备的 9#供试品溶液放置0、 2、4、 8、 12 h 时进样分析， 结果样品在 12 h内共有电泳峰的相对保留时间 RSD≤0.53%， 相对峰面积的 RSD≤4.89%， 表明供试品在测定的 12 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取 9#金钱白花蛇样品 5 份，按 “2.2” 项方法平行制备供试液， 按 “2.3” 项电泳条件进行进样分析，记录电泳图，计算其共有指纹峰的相对保留时间 RSD均≤0.63%， 共有指纹峰相对峰面积的 RSD均≤4.83%， 说明此方法测定的重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 参照物峰的选择 取尿苷对照品溶液及 8#样品供试品溶液，按上述电泳条件进样测定，对照品及 8#样品的 HPCE谱图见图 1、 2， 其峰位及峰面积分别见表 2、 3。 对比迁移时间确定 S 峰为尿苷，在供试液中加入对照品溶液，进样分析，电泳峰增益结果进一步证实了结论正确，故选定S为参照物峰［8］， 以此标定各样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积。

图1 尿苷 HPCE图Fig.1 HPCE fingerprint of uridine

2.5.2 指纹图谱的建立 取 “2.2” 项下方法制备的各供试品溶液，按筛选好的电泳条件进行测试， 测得各供试品的 HPCE谱图。 除 11#样品的HPCE色谱图外 （见图 3）， 各样品的 HPCE色谱指纹图谱具有相似性。 将 1#～10#测试结果导入国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，选择多点校正，色谱峰自动匹配，同时生成对照图谱 R（ 图 4），选取 9 个共有峰，作为构建的指纹图谱特征峰，得到金钱白花蛇药材HPCE色谱指纹图谱共有模式 （图 5）。 金钱白花蛇供试样品的相对保留时间和相对峰面积构成了其指纹特征［9］， 结果见表 2、 3。

图 2 8#样品 HPCE图Fig.2 HPCE fingerprints of 8#

图 3 11#样品的 HPCE图Fig.3 HPCE fingerp rints of 11#

图4 金钱白花蛇药材 HPCE对照指纹图谱 RFig.4 HPCE reference fingerprints of Bungarus Parvus

图5 金钱白花蛇药材 HPCE指纹图谱共有模式Fig.5 M utualmode HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

2.6 指纹图谱的分析与评价 将测得的 1#～10#样品指纹图谱结果及生成的对照图谱导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版”软件，以对照图谱 R为基准， 1#～10#金钱白花蛇药材商品的相似度结果见表4。

3 小结与讨论

3.1 由表 4 结果可见， 1#～10#金钱白花蛇药材商品的 HPCE图谱相对于对照图谱 R的相似度， 除1#样品 （0.635）外均大于 0.9。 按照 《 中药材指纹图谱的技术要求》， 大于 0.9 的样品即认为是同一品 种［10］， 故 2#～10#金 钱 白 花 蛇 药 材 样 品 品种一致。

3.2 关于相似度小于 0.9 的 1#样品， 该批药材除个体较大不符合 《中国药典》 的规定外，品种上与其他样品并无差异；其指纹图谱共有峰的相对保留时间也与其他样品并无异，仅8号峰的相对峰面积明显高于其他样品。由图谱上也可看出峰面积较其他样品大，表明金钱白花蛇商品药材其水溶性成分含有量存在差异。故采用高效毛细管电泳法，不仅可以对金钱白花蛇商品药材进行品种鉴别，同时也可以作为其质量控制的方法。

表2 金钱白花蛇 HPCE指纹图谱共有峰的相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks of HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

表3 金钱白花蛇 HPCE指纹图谱共有峰的相对峰面积Tab.3 Relative peak areas of common peaks of HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

表4 金钱白花蛇商品药材 HPCE指纹图谱与共有模式的相似度Tab.4 Sim ilarity judgment validation of HPCE fingerprints from different sam p les

3.3 由图 3 可见， 金钱白花蛇成蛇 （11#号样品）的 HPCE色谱图中， 3 号峰明显高于其他峰， 而 4、5、 S号峰无响应值， 表明金钱白花蛇其成蛇和幼蛇的水溶性成分差异明显。故采用高效毛细管电泳法，不仅可以对金钱白花蛇药材商品进行品种鉴别，同时对不同生长期的金钱白花蛇进行鉴别。

3.4 本课题组已建立了蕲蛇、 乌梢蛇商品药材的HPCE指纹图谱［7，11］。 比较金钱白花蛇与蕲蛇、 乌梢蛇商品药材的 HPCE指纹图谱 （仅缓冲溶液的摩尔浓度稍有差异，这仅影响电泳图谱的分离度，而对峰的数量影响较小），三种不同来源的蛇类其指纹峰有明显的差异，说明毛细管电泳指纹图谱对其品种的鉴别是有一定意义的。

3.5 参照物峰的选择， 已报道金钱白花蛇药材含有尿苷［2］， 且尿苷是构成动物细胞核酸的主要成分， 并具有 多 种 生 物 活 性［12-13］。 因 此， 本 实 验 选择尿苷作为金钱白花蛇 HPCE指纹图谱的参照物。

3.6 电泳条件的选择

3.6.1 本实验比较了硼酸盐和磷酸盐两种缓冲体系对电泳 的 影 响［14-15］， 结 果 硼 酸盐 缓 冲 体系 的 电泳图谱基线平稳，重复性较好；同时，又分别比较了浓度为 20、30、 50、 70 mmol/L的硼砂缓冲溶液的电泳结果，发现适当的提高缓冲溶液的浓度有利于分离，但因浓度过高产生的焦耳热多，影响其分离效率， 故选用浓度 50 mmol/L缓冲溶液为宜。

3.6.2 本实验还分别考察了电压在 15 ～25 kV时，对分离效果的影响，结果发现随着分离电压的增加，虽迁移时间相应缩短，但由于电流增加，焦耳热增多， 基线噪音变大［16］。 故综合考虑选择电压为20 kV。

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HPCE fingerprint of Bungarus Parvus

XU Jing1， WANG Cheng-fang2， DU Shu-shan2， MENG Fan-yun2， LIFeng1*
（1.College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional ChineseMedicine， Dalian 116600， China； 2.Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine of Beijing Area Major Laboratory， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

AIM To establish a high-performance capillary electrophoresis（HPCE） method for fingerprint of Bungarus Parvus collected from ten differentsources.METHODS 50mmol/L borax-200mmol/L boricacid buffer solution （ pH8.64） was used for electrolyte buffer and the analysiswas performed on Beckman P/ACE System MDQ at column temperature of 25 ℃， isolating voltage 20 kV， and the detection wavelength of 245 nm.RESULTS Nine fingerprint peakswere obtained， and the validation of themethodmet the requirements for SFDA’S technical regulations.CONCLUSION The high-performance capillary electrophoresis fingerprint shows that the electrophoretogram of Bungarus Parvus has a distinct diffence from that of Agkistrodon and Wushaoshe.

Bungarus Parvus； HPCE； fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2014）03-0563-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.025

2013-05-10

国家自然基金资助项目 （30973881）； 高等学校博士学科点专项科研基金项目 （博导类） （20122133110002）

许靖 （1988—）， 女 （ 满 族） ， 硕 士 生， 研 究 方 向： 中 药 材 品 质 评 价。 Tel： （ 0411 ） 87586318， E-mail： xujing020513@ 163.com

*通信作者： 李 峰， 博士生导师。 Tel：（0411）87586318， E-mail： zhanglijiayi@163.com