丹参注射液提取工艺研究

黄和清， 郑斯骥， 赵凤生

（1.上海交通大学药学院， 上海 200240； 2.上海中西制药有限公司， 上海 201806）

丹参注射液提取工艺研究

黄和清1，2， 郑斯骥2， 赵凤生1*

（1.上海交通大学药学院， 上海 200240； 2.上海中西制药有限公司， 上海 201806）

目的 研究并优化丹参注射液的提取工艺。 方法 以丹参有效成分含量和总固体含量为考察指标， 用 HPLC测定药液中有效成分含量， 采用单因素实验， 考察丹参醇沉调碱和水沉调酸过程中药液温度和 pH对有效成分和总固体含量的影响。 结果 醇沉调碱时随着温度和pH的升高， 药液有效成分的损耗率远大于总固体的除去率； 水沉调酸时温度影响不大， pH降低对有效成分含量影响不大， 但总固体量呈减少趋势。 结论 提取丹参注射液的优化工艺为：醇沉调碱过程控制药液温度 25 ～30 ℃， pH 8.0 ～8.5； 水沉调酸过程控制药液温度 20 ～30 ℃， pH 2.0 ～2.2。 按照优化后的工艺在生产规模制备的丹参注射液质量符合标准要求。

丹参注射液；提取；醇沉；水沉

丹参为唇 形 科 鼠尾草属植 物 Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、 活血通经、清心除烦的功效，用于治疗心、脑血管疾病［1-4］。 丹参的有效成分主要分 为两大 类： 水溶性成分 （如丹酚酸类） 和脂溶性成分 （如丹参酮类）［5-8］。丹参注射 液 是 临 床 常 用 的 中 药 针 剂， 利用丹参中水溶性的丹酚酸类有效成分发挥药效作用。丹参注射液的提取已有许多研究。大多数采用水提醇沉 法［9-11］， 水提醇沉 法 已 用 于 工 业 化 生 产。也有其他提取方法的研究， 如大孔 树脂吸 附［12-13］、膜分离［14］， 这些方法还仅限于实验室研究， 尚未应用于工业生产。

目前的丹参注射液标准制备工艺［15］， 是丹参用水提取，经过一次醇沉 （药液含醇量 75%）、二次醇沉 （药液含醇量 85%， pH 8 ～9）， 加注射用水沉淀， 调节 pH至 2 ～3 沉淀， 再经调节 pH、 活性炭脱色、灌封、灭菌等步骤。其中一次醇沉、二次醇沉的目的是除去药液中的淀粉、多糖、蛋白质、树脂、鞣质等水溶性杂质，加注射用水进行水沉和调节药液 pH至2 ～3 的目的是除去药液中丹参酮等脂溶性杂质。但是在除去杂质的同时，药液中的有效成分也随之损失。

丹参注射液质量标准［15］中规定总固体质量浓度为 10 ～30 mg/mL。总固体既包含药液中的丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B等水溶性有效成分，又包含药液中的树脂、鞣质等杂质。要提高产品质量，就要降低丹参注射液的总固体量，又要使有效成分的收率不致降低过多。

丹参中水溶性有效成分丹酚酸B的收率受温度和 pH影响很大， 而丹参注射液标准制备工艺［15］中规定的醇沉和水沉时控制的 pH范围较宽，而且没有明确规定醇沉和水沉时的温度。在实际生产时产品质量不稳定，因此需要在标准制备工艺范围内对丹参注射液的生产工艺进行优化。本实验以丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B的收率与总固体的除去率为指标，考察醇沉调碱、水沉调酸时的温度和pH的影响， 找出最佳的参数控制范围以指导生产。

1 实验仪器、 材料与方法

1.1 仪器与材料 Agilent 1100 高效液相色谱仪（ 德 国 Agilent公 司）； METTLER SevenGo pH-SG2便携式数显 pH计 （梅特勒-托利多公司）； METTLER AE-240 电子 天 平 （ 梅 特 勒-托 利 多 公 司）；HWS28 型电热恒温水浴锅 （上海一恒科学仪器有限公司） ； GZX-GFC-101-2-BS 电热恒温鼓风干燥箱（上海博泰实验设备有限公司）。

丹参饮片，购自山东日照丹参药材基地，经鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参 （ Salvia miltiorrhiza Bunge） 的 干 燥 根； 丹 参 素 钠 对 照 品 （ 批 号110855-201210）、 原儿茶醛对照品 （批号 110810-201007）、 丹 酚 酸 B 对 照 品 （ 批 号 111562-201111），购自中国食品药品检定研究院； 乙腈（分析纯）、 三氟乙酸 （分析纯）、 甲醇 （分析纯）均购自 Merk KGaA公司； 95%乙醇 （药用级）， 购自江苏太仓新太有限公司。

1.2 丹参2 次醇沉的温度和 pH条件优化 本实验所用的丹参提取样品为上海中西制药有限公司中药提取车间的生产中间品，提取按照丹参注射液质量标准中的制备工艺进行［15］。 取丹参 200 kg， 加水煎煮3 次， 第 1 次 2 h， 第 2、3 次各 1.5 h。合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.15 ～1.28 （60 ℃测定） 的清膏。 加乙醇使含醇量为75%， 冷藏 48 h， 过滤。 滤液减压浓缩至相对密度为 1.16 ～1.26 （60 ℃测定） 的清膏， 加乙醇使含醇量为 85%， 静置， 取上清液， 为丹参 2次醇沉液。

取丹参 2 次醇沉液若干份， 每份 500 mL， 分别置于指定温度的恒温水浴锅中。待药液温度恒定后，在搅拌条件下向药液中加入氢氧化钠溶液，调节至指定 pH。 冷藏 48 h， 过滤。 滤液取样测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B的量和总固体的量。每种实验条件做3次平行实验。

1.3 丹参水沉的温度和 pH条件优化 上述丹参 2次醇沉液用氢氧化钠溶液调节 pH至 8 ～9， 冷藏48 h， 过滤。滤液必要时回调 pH至中性， 减压浓缩回收乙醇至无醇味。加注射用水成相对密度为1.01 ～1.05 （60 ℃测定） 的清膏， 冷藏 16 h， 滤过。 滤液浓缩至相对密度为 1.02 ～1.06 （60 ℃测定）的清膏，为丹参水沉液。

取丹参水沉液若干份， 每份 500 mL， 分别置于指定温度的恒温水浴锅中。待药液温度恒定后，在搅拌条件下向药液中加入盐酸溶液，调节至指定pH。 冷藏， 过滤。滤液取样测定丹参素钠、 原儿茶醛、丹酚酸B的量和总固体的量。每种实验条件做3次平行实验。

1.4 车间生产规模丹参提取优化工艺的验证 按照优化的丹参2次醇沉和水沉的工艺条件，在车间生产规模进行提取验证。实验进行3批。

每一批验证实验取丹参 600 kg， 加水煎煮 3次。 第1 次加水6 000 L， 93 ～96 ℃保温2 h， 药液体积 4 860 ～4 930 L。 第 2 次加水 4 200 L， 93 ～96 ℃保温 1.5 h， 药液体积 3 840 ～3 930 L。 第 3次加水3 000 L， 93 ～96 ℃保温 1.5 h， 药液体积2 630 ～2 720 L。 合并 3 次煎液， 体积 11 400 ～11 510 L， 过滤。 滤液 减 压 浓缩至相对密 度 为1.15 ～1.28 （60 ℃测定） 的清膏， 加入乙醇进行1 次 醇 沉， 含 醇 量 为 （75 ±2）%， 药 液 体 积1 380 ～1 412 L， 1 ～6 ℃冷藏48 h。 过滤， 滤液浓缩至相对密度为 1.16 ～1.26 （60 ℃测定） 的清膏， 加入乙醇进行 2 次醇沉， 含醇量为 （85 ± 2）%， 药液体积 1 252 ～1 276 L。 静置， 取上清液， 药液温度控制在 25 ～30 ℃， 用氢氧化钠溶液调节 pH至 8.0 ～8.5， 1 ～6 ℃冷藏 48 h。 过滤，滤液减压浓缩回收乙醇至无醇味，加注射用水成相对密度为 1.01 ～1.05 （60 ℃测定） 的清膏， 进行水沉， 药液体积 337 ～352 L， 1 ～6 ℃冷藏 16 h。过滤， 滤液浓缩至相对密度为 1.02 ～1.06 （60 ℃测定） 的清膏， 滤液温度控制在 20 ～30 ℃， 用盐酸溶液调节 pH至 2.0 ～2.2， 3 ～7 ℃冷藏 24 h。过滤， 滤液用氢氧化钠溶液调节 pH至 6.8 ～7.0，加适量 注射用 水， 药 液体积 122 ～136 L，煮沸0.5 h。 冷至 80 ℃，加入药液体积 1% （W/V） 的活性炭， 搅拌，过滤。 滤液放冷后在3～7℃冷藏。过滤， 加注射用水至 400 L， 调节 pH至 6.5 ～7.2，灌封， 在 105 ℃灭菌 30 min， 即得成品。

1.5 有效成分的定量测定［15］丹参素钠、 原儿茶醛、 丹酚酸 B的测定采用高效液相色谱法。 Kromasil 100-5 C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）。流动相 A为乙腈， 流动相 B为 0.05%三氟乙酸水溶液， 梯度洗脱 （0 ～65 min， 2%→30%A； 65 ～66 min， 30%→2%A； 66 ～80 min， 2%A）。 体积流量 0.8 mL/min。 检测波长 288 nm。 柱温 40 ℃。进样量10 μL。理论板数按丹酚酸 B峰计算应不低于 200 000。

精密称取丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品和丹酚酸 B对照品适量， 加 10% 甲醇溶液 （ 含0.2%冰乙酸） 配制成含丹参素钠 200 μg/mL、 原儿茶醛 50 μg/m L和丹酚酸 B 50 μg/m L的混合溶液，即得对照品溶液。

精密吸取丹参2次醇沉或水沉的条件实验样品5 m L， 置 25 mL的量瓶中， 加 10%甲醇溶液 （含0.2%冰乙酸） 稀释至刻度， 摇匀， 即得供试品溶液。

样品测定采用外标法。

有效成分收率按下式计算：

有效成分收率 /%=

1.6 总固体量的测定［15］精密吸取丹参二次醇沉或水沉的条件实验样品 10 mL， 置已干燥至恒定质量的蒸发皿中， 在水浴上蒸干， 于105 ℃干燥箱中干燥 3 h， 移置干燥器中冷却 30 min， 迅速称定质量。

总固体除去率按下式计算：

1.7 丹参注射液成品中蛋白质、 鞣质、 树脂的测定［15］

1.7.1 蛋白质 取丹参注射液成品 1 mL， 加新配制的 30% 磺基水杨酸溶 液 1 mL， 摇匀， 放置5 min， 不得出现浑浊。

1.7.2 鞣质 取丹参注射液成品 1 mL， 加新配制的含 1%鸡蛋清的生理盐水 5mL， 放置 10 min， 不得出现浑浊或沉淀。

1.7.3 树脂 取丹参注射液成品 5 mL， 置分液漏斗中， 加三氯甲烷10mL振摇提取， 分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸 2 mL使溶解，置具塞试管中， 加水 3 mL， 混匀， 放置 30 min，不得出现沉淀。

1.8 丹参注射液成品中热原、 异常毒性、 过敏试验、 溶血与 凝 聚 的测 定［16］热 原 按 照 《 中 国 药典》 2010 年版一部附录 XⅢ A规定的方法进行测定， 剂量按家兔体质量每 1 kg注射1.5 mL。

异常毒性按照 《中国药典》 2010 年版一部附录XⅢ E规定的方法进行测定，按静脉注射法给药。

过敏试验按照 《中国药典》 2010 年版一部附录XⅢ G规定的方法进行测定。

溶血与凝聚按照 《中国药典》 2010 年版一部附录XⅢ H规定的方法进行测定。

2 实验结果与讨论

2.1 丹参2 次醇沉的温度和 pH条件优化 醇沉所用的乙醇一般在室温存放。根据醇沉调碱实际操作过程中药液的温度， 选取 25、 30、 35 ℃ 3 种条件进行考察。 丹参 2 次醇沉在 pH 8.5， 温度分别为 25、 30、 35 ℃时， 丹参有效成分收率和总固体除去率见表1。

表 1 pH 8.5 时各种温度下丹参 2 次醇沉的结果 （n=3）Tab.1 Results of ethanol sediment of Salvia m iltiorrhiza at pH 8.5 and various tem peratures（n=3）

从表 1 可以看出， 药液 pH 8.5， 温度从 25 ℃升至30℃， 丹参素钠、 原儿茶醛、 丹酚酸 B的收率变化不大，总固体除去率变化也不大；但当温度继续升高至35℃， 丹参素钠、 原儿茶醛、 丹酚酸B收率明显降低，而总固体除去率下降。原因是温度升高，药液中溶解的杂质增多。所以药液温度升高不利于保留其中的有效成分，也不利于总固体的除去。 在实际生产时， 药液温度一般处于常温25～35 ℃的状态， 应控制药液温度在25 ～30 ℃范围。

丹参二次醇沉温度 28 ℃， pH分别为 8.0、8.5、 9.0 时， 丹参有效成分收率和总固体除去率见表2。

表 2 28 ℃时各种 pH下丹参 2 次醇沉的结果 （n=3）Tab.2 Resu lts of ethanol sediment of Salviamiltiorrhiza at 28 ℃ and various pH values（ n=3）

从表 2 可以看出， 药液温度 28 ℃，pH从 8.0升至8.5， 丹参素钠、 丹酚酸 B收率减少， 但总固体除去率增大并高于有效成分的损耗； 当药液 pH继续升高至 9.0 时， 总固体除去率明显增加， 可是丹参素钠、原儿茶醛收率损失较多，丹酚酸B收率损失最多，远高于总固体除去率的增加。因此确定优选 pH范围为8.0 ～8.5。

2.2 丹参水沉的温度和 pH条件优化 丹参水沉在 pH 2.5， 温度分别为 20、25、 30 ℃时， 丹参有效成分收率和总固体除去率见表3。

表 3 pH 2.5 时各种温度下丹参水沉的结果 （n=3）Tab.3 Results of water sediment of Salvia m iltiorrhiza at pH 2.5 and various tem peratures（n=3）

从表 3 可以看出，药液 pH 2.5， 温度从 20 ℃升至30℃时， 丹参素钠、 原儿茶醛、 丹酚酸 B的收率变化很小，总固体除去率的变化也不大，说明水沉调酸时药液温度在 20 ～30 ℃范围对有效成分和总固体的影响较小。在实际生产中，控制药液温度在20 ～30 ℃的室温状态下进行操作。

丹参水沉温度 25 ℃， pH分别为 2.0、 2.5、3.0 时， 丹参有效成分收率和总固体除去率见表 4。

表 4 25 ℃时各种 pH下丹参水沉的结果 （n=3）Tab.4 Results of water sediment of Salvia m iltiorrhiza at 25 ℃ and various pH values（ n=3）

从表 4 可以看出， 药液温度 25 ℃，pH从 2.0升至2.5， 丹参素钠、 原儿茶醛的收率变化很小，丹酚酸B的收率增大较多，总固体除去率略有减少。 pH从 2.5 升至 3.0， 丹参素钠、 原儿茶醛的收率基本上没有改变，丹酚酸B的收率稍有增加，总固体除去率略有减少。着眼于增加总固体除去率， 工艺优选 pH范围为 2.0 ～2.2。

2.3 车间生产规模丹参提取优化工艺的验证 在生产车间按照丹参提取的优化工艺进行验证实验，每一批实验用丹参600 kg， 重复实验3 次， 结果见表 5， 所得丹参提取液成品的质量见表6。

表 5 车间生产规模验证丹参提取优化工艺的结果 （n=3）Tab.5 Results of verification experiments about optim ized technology of Salviamiltiorrhiza extraction on shop scale（ n=3）

表6 车间生产规模优化工艺提取的丹参注射液成品质量Tab.6 Qualities of Salviamiltiorrhiza injection extracted with optim ized technology on shop scale

从表6的数据可以看出，按照优化的丹参注射液提取工艺生产的3批成品的各项指标均达到质量控制要求。

3 结论

目前的丹参注射液标准制备工艺中，关于2次醇沉调碱和水沉调酸时温度和 pH的控制条件， 或者没有明确规定，或者规定的范围较宽，致使生产的产品质量不够稳定。 通过本实验， 对温度和 pH控制参数做出明确和细致的规定，在除去固体物质的同时，尽可能保留有效成分。确定丹参2次醇沉调碱的工艺控制参数为药液温度 25 ～30 ℃， pH 8.0 ～8.5；丹参水沉调酸的工艺控制参数为药液温度 20 ～30 ℃， pH 2.0 ～2.2。 按照优化后的工艺在生产规模制备的丹参注射液质量符合标准要求，操作过程稳定。

从本实验结果可以看出，丹参注射液的醇沉和水沉过程中有效成分的损失较大。主要原因是醇沉和水沉的分辨率较低，在沉淀杂质的同时，相当多的有效成分也一同沉淀出来。醇沉和水沉后冷藏的时间很长，时间和能源消耗大。在以后的工作中，需要进一步探索更有效的分离方法。

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Extraction technology of Danshen Injection

HUANG He-qing1，2， ZHENG Si-ji2， ZHAO Feng-sheng1*
（1.School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China； 2.Shanghai Zhongxi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201806， China）

Danshen Injection； extraction； ethanol sediment； water sediment

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0526-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.017

2013-05-26

黄和清 （1971—）， 男， 硕士生， 研究方向： 中药制剂生产工艺。

*通信作者： 赵凤生， 男， 教授， 研究方向： 生物药物的分离提取。 Tel： （021） 34204528 ， E-mail： fszhao@sjtu.edu.cn