D-101 型大孔吸附树脂纯化黄蜀葵花总黄酮的工艺研究

于鹤云， 刘汉清*， 刘 嘉， 唐海涛， 张 平， 张 坚

（1.南京中医药大学， 江苏 南京 210046； 2.江苏建康职业学院， 江苏 南京 210029； 3.江苏苏中药业集团股份有限公司， 江苏 姜堰 225500）

D-101 型大孔吸附树脂纯化黄蜀葵花总黄酮的工艺研究

于鹤云1， 刘汉清1*， 刘 嘉2*， 唐海涛3， 张 平3， 张 坚1

（1.南京中医药大学， 江苏 南京 210046； 2.江苏建康职业学院， 江苏 南京 210029； 3.江苏苏中药业集团股份有限公司， 江苏 姜堰 225500）

目的 优选 D-101 型大孔吸附树脂纯化黄蜀葵花总黄酮的工艺参数。 方法 以总黄酮、 金丝桃苷、 异槲皮苷、杨梅素、芦丁和槲皮素的回收率、总黄酮纯度为指标，采用Z分综合评分法，通过正交试验优选黄蜀葵花总黄酮的纯化工艺。 结果 确定最优条件为药液总黄酮质量浓度 4.23 mg/mL， pH 4.17， 上样体积流量 2 BV/h （BV为柱体积），5 BV水和 3 BV5%乙醇除杂， 7 BV 70%乙醇洗脱， 洗脱体积流量 2 BV/h。 结论 该工艺条件对黄蜀葵花总黄酮的纯化效果较好。

大孔吸附树脂；黄蜀葵花；总黄酮；纯化工艺

黄蜀葵 Abelmoschusmanihot（L.） Medic是锦葵科秋葵属植物［1］， 其花中主要含有黄酮类、鞣质类、 有机酸类和 长烃类等化合物［2］， 黄酮类物质是目前所知的主要有效成分，黄葵胶囊即是从黄蜀葵花中提取有效成分制成的胶囊剂，临床主要用于治疗各类慢性肾脏病［3］。 工艺生产过程中发现黄葵干浸膏中间体易吸湿，并且胶囊服用剂量较大（一天3 次， 一次 5 粒）， 为此本实验研究大孔吸附树脂纯化富集总黄酮部位，去除部分易吸湿的杂质，减小胶囊服用量。

1 仪器和材料

Ultimate 3000 高效 液相色谱仪 （ 美国 Dionex公司）； Lambda 25 紫外可见分光光度计 （美国PerkinElmer公司） ；HH-4 型数显恒温水浴锅 （ 金坛富华仪器有限公司）； RE-2000E型旋转蒸发器（ 郑州亚荣仪器有限公司） ； Molelement 1710V超纯水机 （ 上海摩勒生物科技有限公司）； GT10-1高速台式离心机 （北京时代北利离心机有限公司）。

金丝 桃 苷 （ 111521-201004， 纯 度 以 93.9%计）、 芦丁 （100080-200707，纯度以 90.5% 计）、槲皮素 （100081-200907， 纯度以 96.5%计） 均购于中国食品药品检定研究院；杨梅素 （上海同田生物技术 有 限 公司， 批 号 为 11012622， 纯度 ≥98%）、异槲皮苷 （四川维克奇生物科技有限公司， 批号为 201010， 纯度≥98%）。 D-101 型大孔吸附树脂 （天津市海光化工有限公司）。乙腈， 色谱纯；其余试剂均为分析纯。黄蜀葵花 （产地为兴化）经南京中医药大学谈献和教授鉴定为锦葵科的黄蜀葵。

2 方法和结果

2.1 紫外分光光度法测定总黄酮的标准曲线绘制精密称取减压干燥 12 h以上的 金 丝 桃苷对照品适量， 用无水乙醇定容配制成质量浓度为0.128 4 mg/mL的对照品溶液， 精密移取对照品溶液 1、 2、3、 4、 5、 6 mL于 25 mL量 瓶 中， 加 蒸 馏 水 至 6 mL， 分 别 准 确 加 入 5 mL醋 酸 盐 缓 冲 液 （2 mol/L醋酸液∶2 mol/L醋酸钠溶 液 =3 ∶1） 和 0.1 mol/L的三氯 化 铝 溶 液 3 m L， 用 蒸 馏 水 定 容 到 刻 度， 混匀， 放置 30 min， 另取 6 mL蒸 馏 水 同 法 制 备 空 白对照溶液， 在 402 nm波长处测定吸光度， 以 吸光度值为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线［4］， 得线 性 方 程 为 A=0.029 9C+0.015 3， r= 0.999 9， 金 丝 桃苷在 5.136 ～30.816 μg/mL范 围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 HPLC法同时测定 5 种成分的标准曲线绘制

2.2.1 色 谱 条件 Thermo scientific Hypersil GOLD色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） ， 检 测 波 长 为360 nm，柱温 30 ℃， 体 积 流 量 为 0.8 mL/min，流动相为乙腈 -0.2%磷酸水， 按表 1 进行梯度洗脱，此条件下对照品与样品均达到较好的分离效果［5］，见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution p rogram

2.2.2 标准曲线绘制 精密称取减压干燥 12 h 以上的金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、芦丁和槲皮素对照品适量，用甲醇定容配制成质量浓度分别为1.615、 1.227、 0.543、 0.091、 0.178 mg/mL的对照品溶液， 精密移取上述对照品溶液各1 mL于10 m L量瓶中， 用甲醇定容即得金丝桃苷 0.161 5 mg/mL、 异槲皮苷0.122 7 mg/mL、 杨梅素0.054 3 mg/mL、芦 丁 0.009 1 mg/mL、槲 皮 素 0.017 8 mg/mL的混合对照溶液。 取混合对照溶液分别稀释成初始质量浓度的 1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16、 1/32的系列混合对照溶液， 分别进样 10 μL， 以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程为： 金丝桃苷 Y1=0.325 15X1+0.117 66，r1=0.999 99； 异槲皮苷 Y2=0.297 47X2+0.070 86，r2=0.999 99； 杨梅素 Y3=0.523 25X3-0.098 16， r3=0.999 97；芦丁 Y4=0.238 01X4-0.003 64，r4=0.999 98； 槲皮素 Y5=0.680 8X5-0.108 3，r5=0.999 9。 金丝桃苷在 5.048 ～161.528 μg/mL范围内、 异槲皮苷在 3.833 ～122.655 μg/mL范围内、 杨梅素在1.697 ～54.292 μg/mL范围内、 芦丁在 0.283 ～9.050 μg/mL范围内、 槲皮素在0.556 ～17.795 μg/m L范围内与峰面积均呈良好的线性关系。

图1 混合对照品 （A） 与样品 （B） 的 HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram s ofm ixed reference substances（A） and sample（B）

2.3 样品溶液的配制方法 称取黄蜀葵花适量，加入20 倍量 70%乙醇提取 3 次， 每次 1 h， 合并提取液后浓缩至无醇味，加适量蒸馏水稀释，离心去除水不溶性杂质， 制得含总黄酮为 12.10 mg/mL的样品溶液。

2.4 大孔吸附树脂的预处理 取 D-101 大孔吸附树脂适量， 用 95%乙醇浸泡 24 h 后， 湿法装柱，用 95%乙醇冲洗至流出液加水无浑浊现象， 再用蒸馏水冲洗至无醇味，备用。

2.5 Z分综合评价法 本实验选取总黄酮、 金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、芦丁、槲皮素回收率以及总黄酮纯度为指标，采用Z分综合评价法将多指标进行归一化处理［6］， 计算公式如下：

Zi=/Si其中：Xi为指标值为指标值的平均值，Si为指标值的标准差［7］。

2.6 分离纯化实验的单因素考察

2.6.1 上样质量浓度的考察 量取 350 mL总黄酮质量浓度为 12.10 mg/mL样品溶液 5 份，分别稀释成 1.13、4.23、 6.72、 8.63、12.10mg/mL的样品溶液。 量取 100 m L经过预处理的 D-101 型树脂，湿法装柱，将上述5份样液分别湿法上样，上样体积流量为4 BV/h， 用 5 BV蒸馏水冲洗， 再用 5 BV 70%乙醇以 4 BV/h 的体积流量进行解吸附， 收集乙醇洗脱液， 按 “2.1”、 “2.2” 项下方法分别测定总黄酮和5种成分的回收率，另取乙醇洗脱液50 mL于蒸发皿中， 105 ℃干燥至恒定质量， 利用差量法测定含固量，计算总黄酮纯度，实验重复3次取其平均值， 结果见表2。

黄酮回收率%=洗脱液中黄酮量/样品溶液中黄酮量 ×100%

总黄酮纯度%=洗脱液中黄酮量/洗脱液的总含固量 ×100%

表2 不同上样质量浓度的考察结果Tab.2 Resu lts of different concentrations of sam p le solution

由表 2 可知， 药液的总黄酮质量浓度在4.23 ～6.72 mg/mL范围内纯化效果较好。

2.6.2 上样药液 pH的考察 量取 5 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL样品溶液各 1L， 分别调 pH值为 2.18、 4.17、 6.01、 8.00、 9.98， 同法上样、洗脱、 检测，其结果见表3。

表3 不同药液 pH的考察结果Tab.3 Results of different pH values of sample solution

由表 3 可知， 药液 pH在2.18 ～4.17 范围内纯化效果较好。

2.6.3 上样体积流量的考察 量取 4 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL样品溶液各 1 L分别以 2 BV/h、 4 BV/h、 6 BV/h、 8 BV/h 的体积流量上样， 同法洗脱、 检测， 其结果见表4。

由表 4 可知， 上样体积流量为 2 BV/h、 4 BV/h时纯化效果较好。

表4 不同上样体积流量的考察结果Tab.4 Resu lts of different flow rates of sam p le solution

2.6.4 不同体积分数乙醇洗脱的考察 量取 5 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL样品溶液各 1 L依法上样、 水洗， 再分别用 5 BV 的 30%、 50%、70%、80%、95%乙醇进行解吸附，收集洗脱液依法检测， 其结果见表5。

表5 不同体积分数乙醇的考察结果Tab.5 Results of different con tents of ethanol

由表 5 可知， 乙醇洗脱体积分数在 70% ～95%范围内纯化效果较好。

2.6.5 乙醇洗脱体积的考察 量取 4 份总黄酮质量浓度为4.23mg/mL样品溶液各1L依法上样、水洗，分别用 1BV、 3BV、 5BV、 7BV的 70%乙醇进行解吸附， 收集洗脱液依法检测， 其结果见表6。

由表6可知， 当乙醇用量达到 5 BV以后，各指标值均较高。

2.6.6 乙醇洗脱体积流量的考察 量取 4 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL样品溶液各 1 L同法上样、 水洗，再用 5 BV 70%乙醇分别以 2、 4、 6、 8 BV/h 的体积流量进行解吸附， 收集洗脱液依法检测， 其结果见表7。 由表7可知， 乙醇洗脱体积流量为 2、 4 BV/h 时纯化效果较好。

2.6.7 除杂洗脱条件的考察 量取 4 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL样品溶液各 1 L同法上样，分别用 5 BV蒸馏水、 8 BV蒸馏水、 5 BV蒸馏水 +3 BV5%乙醇、 5 BV蒸馏水 +5 BV10%乙醇进行冲洗后， 再用 70%乙醇解吸附， 收集洗脱液依法检测， 其结果见表8。

表8 不同除杂洗脱条件的考察结果Tab.8 Results of different parameters of washing p rogram

由表 8 可知， 用 5BV水和 5BV水 +3BV5%乙醇冲洗杂质，纯化效果较好。

2.7 正交试验 以单因素实验结果确定的各因素较优范围， 按 L8（27） 正交表进行实验， 因素水平见表 9， 实验结果见表 10， 其直观分析见表 11，方差分析见表 12。

表9 因素水平Tab.9 Factors and levels

表 10 正交试验结果Tab.10 Results of orthogonal experiment

表 11 正交试验结果的直观分析Tab.11 Intuitive analysis table

表 12 正交试验结果的方差分析Tab.12 Analysis of variance table

由表 11、 12 可知，上样流量和上样 pH具有显著性差异 （P＜0.05）， 因素影响大小为： A＞ B＞G ＞ D ＞ E ＞ C ＞ F， 最 佳 工 艺 为A1B2C1D2E1F2G2， 即上样体积流量为 2 BV/h， 上样 pH为 4.17， 上样质量浓度为 4.23 mg/m L， 乙醇体积分数 70%， 乙醇洗脱体积流量为 2 BV/h，除杂洗脱条件为 5 BV+3 BV5%乙醇，乙醇洗脱体积为7 BV。

2.8 验证试验 量取 3 份已经过预处理的 D-101树脂300 mL， 湿法装柱， 取 3 份总黄酮质量浓度为 4.23 mg/mL的样品溶液 3 L均调节 pH至 4.17，湿法上样， 上样流量为 2 BV/h， 用 5 BV水和 3 BV5%乙醇除去杂质，再用 5 BV的 70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，与正交试验同法检测，结果见表 13。

表 13 验证试验结果Tab.13 Results of verification tests

由结果可知，按优选出的方案纯化黄蜀葵花总黄酮能达到很好的效果。

3 讨论

3.1 本 实 验 考 察 了 AB-8、 D-101、 HPD-100、NKA-9 四种不同型号的树脂对黄蜀葵花总黄酮的纯化效果，以静态吸附率、静态解吸率、动态吸附率和动态解吸率为指标优选出 D-101 型树脂， 其纯化效果较好。3.2 黄葵胶囊中活性成分为总黄酮， 药典中以金丝桃苷的量为指标，本实验以总黄酮、异槲皮苷、杨梅素、芦丁和槲皮素的回收率为综合指标，能更全面客观的说明 D-101 型大孔吸附树脂纯化黄蜀葵花总黄酮方法的可行性和科学性。3.3 根据实验结果发现杨梅素和槲皮素的回收率很高， 甚至大于 100%， 一方面原因是 D-101 对杨梅素和槲皮素的吸附和解吸附效果很好，另一方面可能的原因是部分金丝桃苷、槲皮苷等类似母核的黄酮类成分在酸性条件下水解成槲皮素等［8］， 具体原因有待进一步研究。

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［3］ 赵 青，万毅刚，孙 伟，等.黄葵胶囊对阿霉素肾病肾组织炎症信号通路 p38MAPK的干预作用［J］.中国中药杂志， 2012， 37（19）： 2926-2934.

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Purification of total flavonoids from Abelmoschusmanihot（ L.） M edic by D-101 m icroporous resin

YU He-yun1， LIU Han-qing1*， LIU Jia2*， TANG Hai-tao3， ZHANG Ping3， ZHANG Jian1
（1.Nanjing University of Traditional ChineseMedicine， Nanjing 210046， China； 2.Jiangsu Jiankang Vocational College， Nanjing 210029， China；3.Jiangsu Suzhong Pharmaceutical Group Co.， Ltd， Taizhou 225500， China）

microporous resin； abelmoschusmanihot（ L.） Medic； total flavonoids； purification process

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0520-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.016

2013-05-16

江苏省科技成果转化专项资金项目 （BA2012131）

于鹤云 （1989—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 中药药剂学。 Tel： 18362315623， E-mail： 517193174@qq.com

*通信作者： 刘汉清 （1947—） ， 男， 教授， 研究方向： 药物新剂型与新工艺。 Tel：（025）85811517， E-mail： nzyhqliu@126.com刘 嘉 （1983—）， 男， 讲师， 研究方向： 药物剂型与信息。 Tel： 13770704461