盐酸小檗碱、吴茱萸挥发油、大黄总蒽醌促进苦参碱透皮吸收的量效关系研究

李 芸， 闫治攀， 魏舒畅， 刘永琦

（1.甘肃中医学院， 甘肃省高校中藏药化学与质量研究省级重点实验室， 甘肃 兰州 730000）

盐酸小檗碱、吴茱萸挥发油、大黄总蒽醌促进苦参碱透皮吸收的量效关系研究

李 芸， 闫治攀， 魏舒畅， 刘永琦*

（1.甘肃中医学院， 甘肃省高校中藏药化学与质量研究省级重点实验室， 甘肃 兰州 730000）

目的 研究不同质量分数的盐酸小檗碱、吴茱萸挥发油、大黄总蒽醌对苦参碱透皮吸收的影响。方法 采用YB-P6 型智能透皮试验仪， 以小鼠皮肤为渗透屏障进行体外透皮吸收试验， 采用 HPLC法测定苦参碱的量， 计算累积透过量和透皮速率等渗透动力学参数。 结果 不同质量分数 （5%、 3%、 1%） 的 3 种物质对苦参碱透皮吸收的影响为吴茱萸挥发油 3% ＞1% ＞5% ＞空白， 大黄总蒽醌 5% ＞空白 ＞3% ＞1%， 盐酸小檗碱 空白 ＞1% ＞3% ＞5%。 结论 吴茱萸挥发油对苦参碱有显著的促透作用，大黄总蒽醌不明显，盐酸小檗碱不仅无促透作用，反而抑制其透皮吸收。

苦参碱；透皮吸收；盐酸小檗碱；吴茱萸挥发油；大黄总蒽醌；量效关系

透皮吸收制剂具有可维持稳定的血药浓度、避免肝脏 “首过效应”、 降低药物毒副作用、 给药方便等优点［1］， 是目前最 受 亲 睐的一类新 型 制 剂，每年以 17%的增长率高速发展［2］。 但由于皮肤的屏障作用，使得许多药物的透皮吸收效果往往不甚理想。促进药物透皮吸收，是该类制剂应解决的关键技术。使用透皮吸收促进剂是增加药物透皮吸收的首选方法。由于化学促渗剂氮酮、丙二醇等专属性不强、刺激性较大等诸多缺点，从中药中寻找促渗作用良好、 刺激性小的萜类、 植物精油等［3］天然促透剂已日益受到重视。本实验以苦参碱作为被促渗工具药，从传统中药制剂中使用频率较高的“ 药引类” 中药 吴茱萸［4-8］、 黄 连［6，9］、 大黄［9-10］中提取吴茱萸挥发油、盐酸小檗碱和大黄总蒽醌作为促渗剂，考察这3种天然提取物对标示物苦参碱的透皮促进作用，以发现有促透活性的天然透皮促进剂。

1 实验材料

1.1 仪器 Aglient-1100 高效液相色 谱 仪； DAD检测器；YB-P6 型智能透皮试验仪 （天津天光光学仪器有限公司）； SY3200-T超声清洗机 （上海声源超声波仪器有限公司）； BT125D电子天平 （赛多利斯科学仪器有限公司）；双蒸水机 （Classic series-HeadForce-0902008 力康发展有限公司）。

1.2 试药 吴茱萸饮片 （批号 20080201）、 黄连饮 片 （ 批 号 20080209 ）、 大 黄 饮 片 （ 批 号20080209） 经甘肃中医学院魏舒畅教授鉴定分别为芸 香 科 植 物 吴 茱 萸 Evodia rutaecarpa （ Juss.）Benth 干 燥 近 成 熟 果 实、 毛 茛 科 植 物 黄 连 Coptis chinensis Franch. 的 根 茎、 蓼 科 植 物 掌 叶 大 黄Rheum palmatam L的 干 燥 根 茎。苦 参 碱 对 照 品（中国药品生物制品检定所， 批号 110805-200508，供含量测定用）； 苦参碱 （纯度 ＞98%， 四川成都恩科华生物技术有限公司， 批号 SKH20110768）；吴茱萸挥发油、 盐酸小檗碱 （93.45%）、 大黄总蒽醌 （纯度 94.6%） 均为自制。诗碧脱毛膏 （上海诗碧化妆品有限公司， 批号 50260002）； 甲醇为色谱纯；三乙胺为分析纯；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 SPF级昆明种小鼠， 体质量（20 ±2） g， 雄性， 购于 （甘肃中医学院实验动物中心）， 实 验动物 生 产许可证号： SCXK （ 甘）2011-0001， 实 验 设 施 合 格 证： SYXK （ 甘 ）2011-0001。

2 天然透皮促进剂的制备

2.1 盐酸小檗碱的制备 实验方法采用 70%乙醇提取， 将所得干膏用 0.5%硫酸处理，酸水液加石灰乳 （调 pH 10 ～12）处理， 滤液再用浓 HCl调 pH 1 ～2 处理， 氯化钠盐析， 放置， 所得沉淀反复用热水溶解 HCl调 pH 2 ～3 处理， 得粗总生物碱，用紫外-可见分光光度法测定最高含有量 93.45%。

2.2 吴茱萸挥发油的制备 取吴茱萸药材 1.5 kg，平均分成 3 份， 每份 500 g， 每份加 6 倍量蒸馏水加热回流提取 5 h， 得挥发油 5.7 m L。

2.3 大黄总蒽醌的制备 将大黄饮片以 75%乙醇为溶剂回流提取，浓缩干燥得干膏。取干膏适量，以 8%HCl溶液和三氯甲烷回流提取得到粗大黄总蒽醌。 用 D301 大孔树脂纯化， 以 75%乙醇洗脱，得到大黄总蒽醌，UV法测定含有量以大黄素计为 94.6%。

3 苦参碱体外透皮试验

3.1 分析方法的建立

3.1.1 色谱条件 色谱柱为 Hibar® 250-46，Purospher® STAR，RP-18e（5 μm） sorbent Lot；流动相为甲醇-0.05%三乙胺溶液 （70 ∶30）； 体积流量 1 mL/min； 检测波长 220 nm； 柱温 25 ℃； 进样量 20 μL； 理论塔板数按苦参碱计算不低于 2 000。3.1.2 溶液的制备

3.1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品 4.35 mg， 置 10 mL量瓶中， 用 70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.1.2.2 供试品溶液的制备 将取出的透皮接受液 （因有效透皮面积较小， 故同一样品平行3份，合并） 水浴蒸干， 残渣用甲醇溶解并定容至 2 mL，即得。

3.1.2.3 苦参碱过饱和溶液的制备 称取苦参碱对照品 250.60 mg， 置 50 mL量瓶中， 加入双蒸水，溶解，摇匀，得不溶性混悬液。

3.1.2.4 阴性溶液的制备 取分别含有吴茱萸挥发油、盐酸小檗碱、大黄总蒽醌的水溶液，进行透皮试验12 h， 将透皮接受液蒸干， 残渣用甲醇溶解并定容至2 m L， 即得。

3.1.3 系统适应性试验 取上述对照品溶液、 供试品溶液及阴性对照品溶液，在上述色谱条件下，12 h的阴性样品无干扰。 理论塔板数按苦参碱计算不低于 5 000。 见图 1。

3.1.4 线性关系考察 取苦参碱对照品溶液（0.174 mg/mL），分别进样 1、 5、10、 15、 20、25 μL， 记录峰面积， 以峰面积 （Y） 对进样质量（μg） 进行线性回归， 回归方程为 Y=1 262.4X+ 11.916，r=1.0， 结果 表明： 苦参碱在 0.174 ～4.35 μg内呈良好线性关系。

图1 苦参碱阴性对照、 对照品及透皮样品的 HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram s of negative sam p le， reference substances and transdermal sam p les

3.1.5 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样5 次， 得峰面积 RSD为0.94%

3.1.6 稳定性试验 取供试品溶液， 在 0、1、2、3 d 分别进样 20 μL， 测定峰面积并计算苦参碱的RSD为 1.67%， 说明供试品溶液在 3 d 内稳定。

3.1.7 重复性试验 取同一批样品 5 份， 按供试品溶液的制备方法制备溶液， 按 “3.1.1” 项下色谱条件测定，得苦参碱的 RSD为1.02%。

3.1.8 最低检测限 精密吸取对照品溶液适量，加 70%甲醇逐步稀释至色谱图中苦参碱峰高为噪音的3 倍 （信噪比 S/N≥3）。 苦参碱的最低检测限为 0.01 μg/mL。

3.1.9 回收率试验 取对照品溶液适量， 按“3.2.3” 项下方法所得的 12 h 的阴性溶液稀释成含苦参碱 0.017 4、0.174、 4.35 mg/mL的低、中、高 3 个质量浓度的对照品溶液各 3 份， 进样 20 μL测定， 回收率分别为 98.6%、 102.7%、101.4%，RSD分别为 1.68%、 1.37%、1.13%。

3.2 苦参碱的体外经皮渗透度试验

3.2.1 离体小鼠皮肤制备 取体质量在 18 ～22 g范围内的雄性昆明种小鼠， 实验前 24 h时用脱毛膏脱去腹部绒毛，禁食不禁水。实验时，将小鼠颈椎脱臼处死，剥离腹部皮肤，剔除皮下脂肪组织及粘连物，用生理盐水反复冲洗干净后用生理盐水浸泡， 置4 ℃冰箱保存， 24 h内使用。 使用前仔细检查鼠皮的完整性。

3.2.2 供给液和接受液的制备 供给液由苦参碱过饱和溶液和质量分数为 5% ～1%的透皮促进剂组成。以不加透皮促进剂的苦参碱饱和溶液作为对照。 10 组供给液分别为： A为不含促进剂 （作对照）， B～D为 5% ～1%盐酸小檗碱，E～G为5% ～1%吴茱萸挥发油， H～J为 5% ～1%大黄总蒽醌。接受液为生理盐水。

3.2.3 经皮渗透试验 采用 YB-P6 型智能透皮试验仪， 有效扩散面积为 2.355 （0.785 ×3） cm2，接受室容积为 15 mL。 取小鼠皮肤，用生理盐水冲洗干净，剪成适宜大小，置于透皮扩散池的供给室与接受室之间，固定。角质层面向供给室。将接受室内注入生理盐水作为接受液，并排除气泡，使皮肤里层与接受液完全接触。将安装好的扩散池置于（32 ±0.1） ℃恒温水浴 中， 200 r/min 磁 力搅拌。供给室加入含 （或不含） 透皮促进剂的苦参碱过饱和溶液后封闭，分别于试验开始后 2.0、 4.0、6.0、8.0、 10.0、 12.0 h 时取出全部接受液， 同时补加同体积 （32 ±0.1） ℃预热的生理盐水。 将取出接受液水浴蒸干， 用甲醇定容至 2 m L， 并用HPLC测定。

3.2.4 结果处理 样品按照 “3.1.1” 项下色谱条件进行测定，按下式计算累积渗透量Q n （μg/cm2）。

Cn为第 n 个取样点测得的药物质量浓度， Ci为第 i个取样点测得的药物质量浓度。

以单位面积累积渗透量 （Q）为纵坐标， 时间（t） 为横坐标作图， 得药物累积渗透曲线， 对所得曲线进行回归，求出斜率，即为药物的渗透速率J（μg/cm2· h）。 直 线 与 t轴的 交 点 为 滞 后 时 间（ Tlag） 。增渗倍数 （ ER） 为加入渗透促进剂后与未加入渗透促进剂时药物在 12h 内的透皮速率常数之比。结果见表1。

表 1 不同物质对苦参碱的渗透动力学参数 （n=5，）Tab.1 K inetics parameters of matrine w ith various substances（ n=5，）

表 1 不同物质对苦参碱的渗透动力学参数 （n=5，）Tab.1 K inetics parameters of matrine w ith various substances（ n=5，）

促进 剂 Q/（ μg·cm-2） Q-t方程 r J/（ μg·cm-2·h-1） ER Tlag0.64 5.0%盐酸小 檗碱 62.31 ±3.42 Q=5.711 3t-11.311 0.982 8 5.7113 ±1.09 0.28 1.98 3.0%盐酸小檗碱 157.57 ±7.89 Q=13.482t-13.050 0.992 9 13.482 ±2.09 0.67 0.97 1.0%盐酸小 檗碱 207.65 ±8.90 Q=15.613t-4.748 0 0.953 7 15.613 ±1.78 0.78 0.30 5.0%吴茱萸挥发油 369.38 ±21.90 Q=31.230t-25.496 0.992 5 31.23 ±2.98 1.55 0.82 3.0%吴茱萸 挥发 油 1 319.65 ±31.8 Q=136.50t-257.79 0.994 2 136.5 ±4.89 6.79 1.89 1.0%吴茱萸挥发油 568.44 ±9.06 Q=51.195t-50.329 0.998 5 51.195 ±3.86 2.55 0.98 5.0%大黄总蒽醌 259.12 ±4.90 Q=18.122t-43.411 0.990 1 18.122 ±0.93 0.90 2.40 3.0%大黄总 蒽醌 199.82 ±15.89 Q=16.406t-7.516 7 0.992 8 16.406 ±0.98 0.82 0.46 1.0%大黄总蒽醌 200.67 ±12.90 Q=16.025t空白组 225.11 ±5.56 Q=20.099t-12.892 0.998 4 20.099 ±1.89 —-6.776 7 0.985 2 16.025 ±0.85 0.80 0.42

以取样时间 （t） 为横坐标， 累积渗透量 （Q）为纵坐标， 绘制取样时间-累积渗透量 （Q） 曲线，见图2。

图2 不同物质对苦参碱的透皮促进作用的影响Fig.2 Effect of various substances on penetration enhancement of matrine

结果显示，不同质量分数 （5%、 3%、 1%）的3种物质对苦参碱透皮吸收的影响均具有一定的量效关系，总的趋势，吴茱萸挥发油为 3% ＞1%＞5% ＞空白， 大黄总蒽醌为 5% ＞空白 ＞3% ＞1%， 盐酸小檗碱为空白 ＞1% ＞3% ＞5%。

吴茱萸挥发油对苦参碱有显著的促透作用，并与质量分数呈正相关， 以3%促透作用最好。 大黄总蒽醌对苦参碱促透作用不明显。盐酸小檗碱的促透作用与质量分数呈负相关，说明其不但没有促透作用，反而抑制苦参碱的透皮吸收。

4 讨论

4.1 促 渗 工 具 药 的 选 择 苦 参 碱 （ matrine，Mat）， 化学名 Matddin-15-one， 属于四环喹嗪啶类化合物，分子骨架可看作2个喹嗪啶环的稠合体［11］； 相对分子质量 248.38； 苦参碱最常见的是α-型结晶， 其熔点为 76 ℃； 苦参碱口服后具有吸收快、消除慢和一定程度的首过效应，在家兔体内消除半衰期为 4.6 h［12］。生物利用度低于 44.0%，大鼠口服后绝对生物利用度只有 17.1%左右［13］，在水中的溶解度大于1mg/mL， 在 pH为5 ～9 条件下， 表观油水分配系数在 0.052 ～4.216 之间［14］。苦参碱的理化性质表明它可作为相对分子质量 600道尔顿以下、 熔点200 ℃以下、 油水分配系数适中的较易透过皮肤屏障类药物的代表。

4.2 透皮促进效果比较 本实验考察了质量分数为 5%、 3%、1%的吴茱萸挥发油、 盐酸小檗碱及大黄总蒽醌对苦参碱的透皮促进作用。结果表明，吴茱萸挥发油对苦参碱有显著的促透作用，并具有浓度依赖性， 在 1% ～3%范围内量效关系显著，以 3%促透作用最好， 5%时促透作用下降， 并显著延长透皮时滞；大黄总蒽醌的促透作用不明显；盐酸小檗碱不但没有促透作用，反而抑制苦参碱的透皮吸收，并随浓度的增大，透皮时滞也随之延长，可能是因为促渗物和被促渗物均为生物碱，存在竞争性抑制现象。实验提示：被考察的3种提取物中，唯吴茱萸挥发油具有促透活性，可进一步研究其透皮促进机理，这将在后续工作中进行。

4.3 透皮屏障的选择、 处理与保存 实验筛选了大鼠、小鼠腹部相同部位皮肤的渗透效果，结果大鼠皮肤的透皮时滞较长，均在6 h以上，因此本实验选用小鼠腹部皮肤，并且是完全相同的部位，以减少实验误差。另外鼠皮是否新鲜、鼠皮处理是否符合要求，都直接影响实验结果。本实验采用剥皮的前一天脱毛，实验前1 d下午甚至晚上剥皮，除尽脂肪组织和粘连物后浸泡于生理盐水中，置4℃冰箱冷藏，于次日清晨五、六点钟取用，能保证皮肤的新鲜和渗透性能。

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Quantitative dose-effect relationship study of berberine hydrochloride，volatile oil from Euodiae Fructus and total anthraquinone in Rhei Radix et Rhizoma on percutaneous absorption ofmatrine in vitro

LIYun， YAN Zhi-pan， WEIShu-chang， LIU Yong-qi*
（Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional ChineseMedicines of the CollegeofGansu Province， Gansu Collegeof Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

matrine； transdermal absorption； berberine hydrochloride； volatile oil from Euodiae Fructus； total anthraquinone in Rhei Radix et Rhizoma； dose-effect relationship

R944

： A

： 1001-1528（2014）03-0510-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.014

2013-06-17

2009 年兰州市科技局项目 （2009-2-11）

李 芸 （1973—） ， 女， 硕士， 副教授， 硕士 生导师， 研 究方向： 中药加工 炮制与制剂 工艺。 Tel： 13893362959， E-mail：liyunherb@163.com

*通信作者： 刘永琦 （1973—） ， 男， 硕士， 教授， 硕士生导师， 研究方向： 中药免疫学与干细胞生物学。 Tel： 13919019578， E-mail：liuyongqi73@163.com