当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的测定及大鼠体内的药动学

张海胜， 乔 华， 常 威， 张晓云， 邵婷玑， 薛 虎， 赵云峰

（1.渭源县莲峰中心卫生院， 甘肃 定西 748208； 2.兰州大学第一医院药物临床试验机构， 甘肃 兰州730000；3.兰州大学药学院， 甘肃 兰州 730000）

当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的测定及大鼠体内的药动学

张海胜1， 乔 华2， 常 威2， 张晓云3， 邵婷玑3， 薛 虎3， 赵云峰3

（1.渭源县莲峰中心卫生院， 甘肃 定西 748208； 2.兰州大学第一医院药物临床试验机构， 甘肃 兰州730000；3.兰州大学药学院， 甘肃 兰州 730000）

目的 了解市售当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的量及口服后藁本内酯在大鼠体内的药动学。方法 用气相色谱法测定当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的量， SD大鼠灌胃给药， 在设定的时间点采血0.3 mL， 离心分离血浆， HPLC法测定藁本内酯的血药浓度，计算药动学参数，与藁本内酯静脉注射给药比较，对其在大鼠体内的药动学特征进行评价。结果 当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的量为 0.19mg/粒。 当归腹痛宁滴丸灌胃给药后， 藁本内酯 25mg/kg组， 其 Cmax为 （620.395 ±47.69） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（709.346 ±77.775） μg/L·h，t1/2z（4.331 ±1.278） h； 12.5 mg/kg组 Cmax为（173.902 ±13.654） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（365.003 ±72.813） μg/L·h，t1/2z（2.236 ±0.188） h； 静脉注射藁本内酯 25mg/kg后 Cmax（ 675.965 ±41.968 ） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（ 949.501 ±63.182） μg/L·h，t1/2z（ 3.085 ± 0.137） h； 静脉注射 12.5mg/kg时 Cmax（391.402 ±25.251） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（391.078 ±26.609） μg/L·h，t1/2z（2.985 ±0.241） h。 结论 当归腹痛宁滴丸口服， 其有效成分藁本内酯胃肠道吸收迅速， 生物利用度高， 给药后药时曲线呈双吸收峰，可能与滴丸中藁本内酯释放特征有关。

当归腹痛宁滴丸；藁本内酯；药动学

当归腹痛宁滴丸是以当归挥发油为主要原料制成的滴丸剂，具有解痉止痛的功效。主要用于妇女痛经，产后宫缩痛，感染性腹泻引起的急性腹痛，小儿秋季腹泻等的治疗。 藁本内酯为其主要有效成分之一［1-2］。 研究表明： 藁本内酯有很强的解痉、平喘、镇定作用，临床上可用于治疗支气管炎和妇科疾病［3-5］。 研 究 显 示［6］， 藁 本 内 酯 具 有 良好的改善微循环作用，可用于防治与微循环障碍有关的疾病， 对大鼠脑缺血有显著保护作用［7］。 藁本内酯对癌细胞L1210， K562 具有很强抑制作用， 其 IC50分别为 （2.27 ± 0.10）、 （ 4.78 ±0.18） μmol/L， 可用于 肿 瘤 的辅助治疗［8］。 此 外， 藁 本 内 酯 还 可 以 抑 制 平 滑 肌 增 殖［9］、 抑菌［10-11］、 松弛 平 滑 肌， 可 用 于 治 疗 眼 睛 疲 劳 以 及 皮 肤 抗皱［12］。 基于以上药理学基础， 为了了解市售当归妇痛宁滴丸中藁本内酯的量，并了解其口服给药后的药动学特征，本实验以大鼠为研究对象，进行当归腹痛宁滴丸口服给药后藁本内酯的药动学研究。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 当归腹痛宁滴丸 （兰州和盛堂制药有限公司， 国药准字 Z62020027）； 藁本内酯对照品 （川芎挥发油经分离纯化， 纯度 97.26%）； 鬼臼毒素 （北京医科大学应用药物研究所）； 氯苯那敏 （河南九势制药股份有限公司）； 甲醇， 乙腈 （色谱纯， 山东禹王实业有限公司）； 二氯甲烷 （色谱纯， 天津市凯信化学有限公司）， 石油醚（分析纯， 利安隆博华医药化学有限公司）； 乙酸乙酯 （分析纯， 利安隆博华医药化学有限公司）； 肝素钠 （上海中秦化学试剂有限公司），纯水自制。

1.2 实验动物 SD大鼠， 雌雄各半， 体质量 180 ～220 g，购自 兰 州 大 学 动 物 中 心， 合 格 证 号： SCXK （ 甘 ）2009-0004。

1.3 实验仪 器 Agilent 7890A气 相 色 谱 仪 （ 氢 火 焰 检 测器， 16 位自动 进 样器， 美国） ； Agilent1200 高效 液 相 色 谱系统 （G1311A四元泵， G1329A自动进样器， G1321A荧光检测器， G1316A柱温箱， 德国）； DT224-S 电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）； H2050R台式高速冷冻离心机 （ 长沙湘仪离心机有限公司）； HGC-24A氮吹仪（天津恒奥有限责任公司）。

2 实验方法

2.1 当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的测定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 内标溶液的配制 精密称取 5.0 mg扑尔敏于5 mL量瓶中， 甲醇溶解并稀释至刻度， 得 1.0 mg/mL的扑尔敏溶液。 精密吸取 2 mL， 置 10 mL量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 得 0.2 mg/mL的扑尔敏内标溶液。

2.1.1.2 藁本内酯标准系列溶液的配制及处理 精密称取藁本内酯对照品 （含藁本内酯 97.26%） 适量， 甲醇溶解并稀释得 0.8、 0.6、 0.4、 0.3、 0.2、 0.1、 0.04、 0.02 mg/mL的藁本内酯标准系列溶液， -40 ℃储存备用。 分别吸取上述系列标 准 溶 液 100 μL于 1.5 mL的 离 心 管 中， 各加0.2 mg/mL扑尔敏溶液100 μL， 涡旋30 s， 10 800 r/min 离心5 min， 进样。

2.1.1.3 当归腹痛宁滴丸溶液的配制及处理 取当归腹痛宁滴丸10 粒， 精密称重， 每粒滴丸的平均质量为0.056 1 g。精密称取 0.112 3 g（相当于两粒滴丸） 于 10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度， 得到 11.2 mg/mL的滴丸溶液。取该溶液 100 μL于 1.5mL离心管， 加0.2mg/mL的扑尔敏内标溶液 100 μL， 混 匀， 离 心 （10 800 r/min） 5 min 后进样。

2.1.2 气相色谱分离条件及方法特异性 Agilent7890A气相色谱仪， 采用 HP-5 石英毛细管色谱柱 （30 m×320 μm ×0.25 μm）， 以氮气为载气， 载气体积流量 4 mL/min， 分流比 30 ∶1， 柱温采用程序升温， 升温程序为 100 ℃保持2 min后， 以 5 ℃ /min 的速度升高至 240 ℃， 并保持 2min。进样量为 1 μL， 采集时间为 13.33 m in。 取 “2.1.1.2” 项及 “2.1.1.3” 项 溶液 进 样 分 析， 得 藁 本 内 酯 （8.198 m in） 、 扑尔敏 （10.175 min） 气相色谱图。 见图 1 ～3。

图1 空白气相色谱图

图 2 藁本内酯 （8.198m in） ， 扑尔敏 （10.175m in） 气相色谱图

图3 当归腹痛宁滴丸及内标扑尔敏气相色谱图

2.1.3 标准曲线的制备及线性 取 “2.1.1.2” 项配制的系列溶液， 按 “2.1.2” 项色谱条件进样分析， 以藁本内酯与扑尔敏色谱峰面积比对溶液质量浓度线性回归，得藁本内酯标 准 曲 线 方 程 C=0.093 9SGBNZ/IS+0.011 4 （ r2= 0.997 8）， 线性范围 0.02 ～0.8 mg/mL。

2.1.4 当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的测定 取 “2.1.1.3”项下配制的样品溶液， 按 “2.1.2” 项色谱条件进样分析，平行测试两次， 将面积比代入 “2.1.3” 项标准曲线方程，计算藁本内酯的量，并根据稀释倍数计算得每粒滴丸中藁本内酯的量为 0.19 mg藁本内酯 （0.34%）。

2.2 当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的药动学

2.2.1 标准溶 液的制 备 精密称取藁 本 内酯对照品10.0 mg（含藁本内酯 97.26%， 实称 10.2 mg）， 置 10 mL量瓶中， 加乙腈并稀释， 定容至刻度， 得 1 mg/mL藁本内酯贮备液， -40 ℃冰箱储存备用。 临用时以乙腈稀释配制成质量浓度为 0.009 7、 0.019 5、 0.039、 0.078、 0.156、0.313、 0.625、 1.25、 2.5、 4.0、 5.0、 10、 20、 40 μg/mL的藁本内酯标准系列溶液。

精密称取鬼臼毒素5.0mg， 置5mL量瓶中， 乙腈溶解并定容， 制成 1 mg/mL的鬼臼毒素溶液。 临用前， 加乙腈稀释成 10 μg/mL的鬼臼毒素内标溶液。

精密称取藁本内酯 25.4 mg， 置 5 m L量瓶中， 加注射用磷脂 25 mg， 无水乙醇 200 μL， 涡旋混匀， 用生理盐水稀释至刻度， 摇匀制得 5 mg/mL藁本内酯乳剂， 供大鼠口服及静脉注射。

精密称取当归腹痛宁滴丸粉末 1.46 g（相当于滴丸26 粒）， 加生理盐水混合均匀， 转移至 5 mL量瓶中， 涡旋混匀得 0.5 g/mL的滴丸混悬液 （供低剂量组大鼠灌胃给药）。 另取2.19 g的滴丸粉末， 同法配制0.73 g/mL的滴丸混悬液 （供高剂量组大鼠灌胃给药）。

2.2.2 藁本内酯血药浓度测定的色谱条件 采用 YMC-pack ODS-A （150mm×4.6mm， 5 μL） 色谱柱， 流动相乙腈-水 （1 ∶1）， 体积流量为 1.0mL/min， 柱温 50 ℃， 用荧光检测器。 0 ～4 min， Ex为 290 nm， Em为 395 nm， 在4 ～14 min， Ex为 336 nm， Em为 453 nm。 进样量 50 μL。

2.2.3 方法专属性 取大鼠空白血浆 100 μL， 置 1.5 mL离心管中，加鬼臼毒素内标溶液及藁本内酯标准溶液各25 μL， 涡旋混匀， 加二氯甲烷 1 mL， NaCl少许， 涡旋提取 5min， 10 800 r/min 离心 5min， 取二氯甲烷层， 氮气吹干， 残渣用 100 μL流动相溶解， 按 “2.2.2” 项色谱条件进样 50 μL。 得藁本内酯及内标加空白血浆的色谱图， 见图 4。 鬼臼毒素的保留时间约为 3.3 min， 藁本内酯的保留时间约为 12.4 min， 同法处理用药后采集的血浆样品， 进样分析，从中可以看出，藁本内酯及内标和内源性杂质之间无干扰。

图4 高效液相色谱图

2.2.4 标准曲线的制备及线性 取 “2.2.1” 项配制的标准系列溶液， 按 “2.2.3” 项方法处理并进样测定， 以藁本内酯的血药浓度为横坐标，藁本内酯与鬼臼毒素的色谱峰面积比为纵坐标进行线性回归计算，得两条标准曲线方程：Y= 133.49X-14.27 （r=0.999 5， 线性范围为 2.44 ～156 ng/mL），Y=145.61X+13.76 （r=0.999 6， 线性范围为 0.156 ～10 μg/mL， 藁本内酯血药浓度与色谱峰面积比在各自的范围之内线性关系良好。

2.2.5 精密度和回收率试验 按 “2.2.3” 项方法配制质量浓度为 4.88、 39、 156、 1 250、 5 000 ng/mL的藁本内酯大鼠血浆样品并按该方法处理，进样分析，一日内连续进样5 次， 连续测定 3 日， 计算日内及日间 RSD。 结果见表1。将藁本内酯与鬼臼毒素峰面积比代入标准曲线方程， 计算藁本内酯血药浓度，与配制浓度比较计算方法回收率（表1）。 结果显示该方法的精密度和准确度符合定量测定的要求。

表 1 测定方法的精密度和回收率 （n=5）

2.2.6 动物实验 取 SD大鼠 24 只， 体质量 180 ～220 g之间， 雌雄各半， 购买后适应性饲养 48 h， 实验前禁食 12 h，期间自行饮水。 将 SD大鼠随机分为4组， 每组 6只， 分别为藁本内酯静脉注射组 （25、 12.5 mg/kg）， 当归腹痛宁滴丸 25 mg/kg剂量组及 12.5 mg/kg剂量组。 取 “2.2.1” 项下配制的藁本内酯乳剂，静脉注射组依大鼠体重尾静脉注射给予适当的药量。当归腹痛宁滴丸组则灌胃给予适当体积的滴丸混 悬液， 并于静 脉 注 射及灌胃后 5 min、 15 min、30 min、 45 min、 1 h、 2 h、 3 h、 5 h、 8 h、 12 h、 24 h 眼眶采血 0.3mL， 肝素抗凝， 离心分离血浆， -40 ℃低温保存备测。

2.2.7 血药浓度的测定及药时曲线 取 “2.2.5” 项采集的血浆 100 μL， 加 内标 25 μL， 乙腈 25 μL， 混匀， 按“2.2.3” 项方法处理， “2.2.2” 项色谱条件进样分析， 测定血药浓度， 绘制药时曲线，见图5。

2.2.8 主要药动学参数 对上述血药浓度时间数据， 经DAS2.1 统计分析， 得主要药动学参数， 见表 2。

3 讨论

3.1 藁本内酯具有苯肽结构， 很不稳定， 易发生脱氢、 氧化、 水解等多种异构化或降解反应［13］， 药品在储存过程中成分含有量逐渐降低，影响药效，因此，实验对当归腹痛宁滴丸中藁本内酯的量进行了考察。

表2 主要药动学参数

图5 血药浓度 -时间曲线图

3.2 在藁本内酯血药浓度分析的过程中， 为了提高测试的灵敏度，本实验针对藁本内酯具有脂溶性，荧光较强的特点，采用二氯甲烷提取，荧光检测器检测的方法进行血药浓度分析， 仅用 0.1mL血浆， 定量下限达 2.44 ng/mL。

3.3 从药时曲线可以看出， 藁本内酯静注后在体内的分布符合二室模型，其血药浓度迅速达到峰值并快速向周围组织分布形成分布项，其消除项血药浓度降低相对较慢。当归腹痛宁滴丸灌胃给药后，其吸收也很迅速，并很快达到峰值，这可能与藁本内酯具有较高的脂溶性，其中速释部分释放后迅速吸收有关。同静脉注射相比，滴丸口服给药后存在双吸收峰，这可能与滴丸中部分藁本内酯后续缓慢释放有关。经计算，当归腹痛宁滴丸口服后在大鼠体内的生物利用度约为 74.7% ～93.3%。

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R969.1

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： 1001-1528（2014）05-1068-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.043

2013-03-15

张海胜 （1978—） ， 男， 主管药师， 主要从事中药研究及调剂。 E-mail： qhbrian@163.com