三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性研究

徐春蕾， 薛 平， 吴玉兰， 张 芳， 李 祥*

（1.南京中医药大学药学院， 江苏 南京 210023； 2.常州药品检验所， 江苏 常州 213003）

三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性研究

徐春蕾1， 薛 平2， 吴玉兰1， 张 芳1， 李 祥1*

（1.南京中医药大学药学院， 江苏 南京 210023； 2.常州药品检验所， 江苏 常州 213003）

目的 考察三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性。 方法 采用 HPLC测定三白草酮及衍生物在常用溶剂中的溶解度和正辛醇-水/缓冲液体系中的表观脂水分配系数 （P）； 采用 CCl4小鼠肝损伤模型考察其保肝活性。 结果25 ℃时三白草酮及衍生物 A、 B、 C在水中的溶解度分别为 （0.161 ±0.007）， （12.4 ±0.57）， （0.145 ±0.006），（0.667 ±0.031） mg/L； 在正辛醇 /水中的 lgP分别为 （3.32 ±0.13）， （2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）；衍生物A的保肝降酶活性较三白草酮有所提高，衍生物B与三白草酮相当，衍生物C有肝损伤作用。结论 衍生物A的 lgP比三白草酮降低较多， 可能会通过改善体内吸收提高药效； 衍生物 C的 lgP虽有下降， 但三白草酮中一个次甲二氧基被破坏，显示出肝损伤作用。

三白草酮； 衍生物； 溶解度； 脂水分配系数； HPLC； 保肝活性

三白草酮 （ sauchinone） 是从中药三白草 Sau- rurus chinensis中分离得到的木脂素类化合物［1］， 其含有量高达 0.4%。 研究表明三白草酮具有保肝活性［2-6］， 但药动学实验发现其在 体内的 吸收差， 且消除很快［7］。 初步研究表明三白草酮的水溶性和脂溶性都很差，又因为余凌虹等构建的活性更强的3 个五味子素衍生物都有次甲二氧基和羟基［8］， 可见在具有次甲二氧基的基础上再引入羟基很可能会增强药物保肝活性，引入羟基还可能增加水溶性，改善化合物的脂水分配。因此，为了考察三白草酮中羟基及次甲二氧基对活性的影响，本实验室对三白草酮结构修饰得衍生物 A、 B、 C， 本研究测定三白草酮及衍生物 （图 1） 的平衡溶解度、 表观脂水分配系数，并结合保肝活性，推测化合物结构和溶解性的改变对药效的影响。

图1 三白草酮及衍生物 A、 B、 C结构Fig.1 Structures of sauchinone， derivative A， B and C

1 仪器、试药与动物

Agilent1200 高效液相色谱仪，G1315D型 DAD检测器， Agilent1200 色 谱 工 作 站； SZ-1 型 快 速 混匀器 （江苏金坛市全城国胜实验仪器厂）； Anke TGL-16C高速离心 机 （ 上海 安 亭 科学仪器厂）；Thermomixer Compact恒温混匀器 （ 德国 Eppendorf公司）； PHS-25 型 pH 计 （ 上 海 雷 磁 仪 器 厂）；AEL-40SM电子分析天平 （ 日本 SHIMADZU公司，精确到 0.01 mg）； 96 孔细胞培养板 （海门 Boyang公司）。

三白草酮及衍生物 A、 B、 C（自制， 纯度＞98.0%， 经1H-NMR、13C-NMR确定结构， HPLC测定纯度）。 谷丙转氨酶 （ALT） 测定试剂盒 （南京建成生物工程研究所， 批号 20120921）； 谷草转氨酶 （AST） 测定试剂盒 （南京建成生物工程研究所， 批号 20120920）； 甲醇为色谱纯 （江苏汉邦科技有限公司， 批号 110738）； 水为重蒸水； 其余试剂均为分析纯。

昆明种小鼠， 清洁级，初始体质量 18 ～20 g，雄性，上海斯莱克动物有限责任公司提供，合格证号 2007000541228。

2 方法与结果

2.1 平衡溶解度及脂水分配系数的测定

2.1.1 色谱条件 Agilent HC-C18色谱柱 （4.6 mm ×250 mm， 5 μm）； 流动相甲醇-水 （85 ∶15）； 体积流量 1.0 mL/min； 取各化合物最大吸收波长为检测波长， 240 nm （三白草酮），300 nm （ A），300 nm （B）， 230 nm （C）；柱温 25 ℃。三白草酮及衍生物 A、 B、 C的保留时间分别为 6.111、5.268、 7.896、 5.329 min。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取三白草酮及衍生物 A、 B、 C各 2.00 mg， 置 2 mL量瓶中， 加适量甲醇溶解并稀释， 配成质量浓度为 1 g/L的贮备液， 采用逐级稀释法配成 100、 80、 60、 40、 20、10、 5、 1、0.5 mg/L不同质量浓度的标准溶液，分别精密吸取三白草酮及衍生物 A、 B、 C标准溶液20 μL， 注入液相色谱仪， 按 “2.1.1” 项色谱条件测定，记录峰面积。以各化合物的质量浓度（mg/L） 为横坐标， 峰面积为纵坐标，得其线性回归方程分别为 Y=27.84X-8.31 （r2=0.999 7），Y=16.26X-4.19 （r2=0.999 5）， Y=14.57X-1.35 （r2=0.999 5 ）， Y=31.44X+3.95 （ r2= 0.999 4）。 结果表明，三白草酮及各 衍生物在0.5 ～100 mg/L间质量浓度和峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度考察 分别取质量浓度为 20 mg/L的三白草酮及衍生物 A、 B、 C的对照品溶液， 按“2.1.1” 项色谱条件连续进样 6 次， 每次 20 μL，记录峰面积。 结果三白草酮及 A、 B、 C峰面积的RSD分别为 0.91%、 0.72%、 0.97% 和 0.63%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 准确度考察 精密吸取 20 mg/L的三白草酮甲醇溶液 1 mL， 分别加入 16、 20、 24 mg/L的三白草酮对照品溶液 1 mL， 每个质量浓度平行 3份， 摇匀，按 “2.1.1”项色谱条件进样 20 μL，由标准曲线计算的三白草酮的平均加样回收率为100.36%， RSD为 1.86%； 同法测 定衍生物 A、B、 C的平均加样回收率分别为 99.56%、 99.94%和 100.44%， RSD 分 别 为 2.21%、 2.65%和 2.72%。

2.1.5 在常用溶剂和不同 pH缓冲液中平衡溶解度考察 分别取过量的三白草酮及衍生物 A、 B、C， 置 2 mL具塞试管中， 分别加入 1.0 mL水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、石油醚，平行3份。超声溶解10 min （使成饱和溶液） 后， 于 25 ℃下恒温混匀器中， 300 r/min 振荡 6 h， 离 心 （ 12 000 r/min，10 min）， 各吸取上清饱和液， 除水溶液经适当浓缩后吸取 20 μL， 其余溶液均经适当稀释后吸取10 μL，注入液相色谱仪， 记录峰面积， 以标准曲线法计算三白草酮及各衍生物在各溶剂中的溶解度，见表1。

表 1 三白草酮及各衍生物在不同溶剂中的平衡溶解度 （n=3）Tab.1 Solubility of sauchinone and its derivatives in different solvents（ n=3）

由表1可见三白草酮及各衍生物在极性较大和较小的溶剂中溶解度较小，而在中等极性溶剂中溶解度较大，在水中溶解度较低， 但A、C在水中的溶解度较三白草酮已有明显改善，A尤为明显。

按药典方法配制 pH为 6.86 的磷酸盐缓冲液，分别以 0.1 mol/L NaOH和 2%H3PO4调节一系列pH 为 2.26、 4.00、 5.20、6.86、 7.40、 8.70、11.87 的磷酸盐缓冲液。分别取适量缓冲液置2 mL具塞试管中，加入过量的三白草酮及各衍生物，平行 3 份， 超声溶解 10 min （使成饱和溶液）后，于 25 ℃下恒温混匀器中， 300 r/min 振荡 6 h， 离心 （12 000 r/min， 10 min）， 各吸取上清饱和液，经适当浓缩后吸取20 μL， 注入液相色谱仪， 记录峰面积。 三白草酮及衍生物 A、 B、 C在不同 pH缓冲液中的溶解度见表2。

表 2 三白草酮及各衍生物在不同 pH的缓冲液中的溶解度（n=3）Tab.2 Solubility of sauchinone and its derivatives in different pH bu ffers（n=3）

由表2可见，三白草酮及各衍生物溶解度随pH值的增大而略有降低， 推测是由于分子中氧原子在酸性溶液中被质子化而加大了它们的溶解度。

2.1.6 正辛醇 /水系统 中表观 分配系数测定 P［9-11］

取三白草酮及各衍生物适量，溶于水饱和的正辛醇中， 使成饱和状态， 静置后离心 （12 000 r/min，10 min）， 精密吸取上清液 0.2 mL置 2 m L具塞试管中， 分别加入正辛醇饱和的水及一系列不同 pH的磷酸盐缓冲液各 1.5 mL， 平行 3 份。于 25 ℃下恒温混匀器中， 300 r/min 振荡 6 h， 静置 0.5 h，分别吸取正辛醇相和水相，正辛醇相经适当稀释后吸取10 μL，水相经适当浓缩后吸取 20 μL， 注入液相色谱仪，记录峰面积。按照下列公式计算三白草酮及各衍生物的表观脂水分配系数。

上式中， P为表观脂水分配系数， Cx为分配平衡时药物在正辛醇相浓度， Cw为分配平衡时药物在水相中的浓度， Vx为正辛醇相的体积， Vw为水相的体积。 得 25 ℃下三白草酮及衍生物 A、 B、 C在正 辛 醇 /水 中 的 lg P 分 别 为 （ 3.32 ±0.13 ），（2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）。三白草酮及各衍生物在正辛醇 /缓冲液中的 lg P与pH的关系见图 2。

由图 2 可见三白草酮及各衍生物的 lgP随着水相 pH的升高略有增加。 衍生物 A、 C的脂水分配系数比三白草酮减小很多，表明衍生物A、C在水相中的分配较三白草酮提高不少。

图2 三白草酮及各衍生物在不同 pH缓冲液中的表观分配系数 （n=3）Fig.2 Partition coefficients for the n-octanol-buffer solution system s of sauchinone and its derivatives（ n=3）

2.2 保肝活性研究

2.2.1 四氯化碳肝损伤模型的建立及给药 取小鼠 120 只， 随机分为 12 组， 即 正常组、模型组、三白草酮组、衍生物的高、中、低剂量组，每组10只。 适应性饲养3 d后， 除正常组和模型组给予相同体积的 0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃外， 三白草酮组给予 50 mg/kg的 三白草酮灌 胃 给药， 其他三白草酮衍生物 A、 B、 C各组分别给予 10、20、 50 mg/kg灌胃 给 药， 1 日 1 次 ， 连 续 7 d。 末次给药1 h后， 除正常组给予等体积的花生油外，其他各组小鼠腹腔注射 0.1%的四氯化碳花生油10 mL/kg，随即禁 食 不 禁 水， 间 隔 16 h 后， 眼 眶静脉取血， 血 样 于 37 ℃ 水 浴 放 置 30 min 后， 于3 500 r/min离 心 10 min， 分 离 血 清 ， -20 ℃ 保 存待测。

2.2.2 血清 ALT、 AST检测 按试剂盒操作说明检测。

2.2.3 数据处理 实验数据采用 EXCEL软件进行统计处理，结果用表示， 组间差异比较采用独立样本 t-test分析， 计算 P值。

2.2.4 实验结果 由表 3 可见， A、 B的 ALT和AST值随着药物剂量的增加而降低， 表明两者对CCl4形成的肝损伤有保护作用， 且保护作用随着剂量的增大而加强，三白草酮衍生物A的保肝降酶效果比三白草酮好，而三白草酮衍生物B与三白草酮相当。三白草酮衍生物C无保肝降酶作用，反而使 ALT、 AST值升高。

3 讨论

本研究采用 HPLC法考察三白草酮及衍生物A、 B、C的平衡溶解度和脂水分配系数；采用CCl4肝损伤小鼠模型考察它们的保肝活性。 结果表明，三白草酮衍生物A、C较三白草酮在低极性溶剂中的溶解度提高较多，三白草酮衍生物A的提高尤为明显；药效学研究表明三白草酮衍生物A的保肝效果较三白草酮有所改善，说明改善化合物的脂水分配确实能提高药效，三白草酮衍生物C中一个次甲二氧基被破坏，已显示出肝损伤作用。

表 3 三白草酮及衍生物对血清 ALT和 AST的影响 （n= 10）Tab.3 Effect of sauchinone and its derivatives on the levels of ALT and AST（n=10）

体外测定脂水分配系数是为了模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。 正辛醇-水和正辛醇-缓冲液分配系数在预测药物吸收上具有重要意义［12］。 Lipinski规则指出， 如果一个药物分子具有好的吸收和穿透 特 性， lg P应 小于 5［13-14］， 又有研究表明［15］， lg P介于 0 ～3 的化合物可以口服给药且在肠道中较易被吸收，三白草酮衍生物A、C的 lg P值均小于 3， B的 lg P值与三白草酮相当，说明羟基的存在能提高水溶性，改善脂水分配。药效学研究表明A的降酶效果比三白草酮提高不少，这可能是A的脂水分配改善后体内的吸收得到提高，所以提高了药效。但C已显示出肝损伤作用，有文献报道［8］次甲二氧基为保肝活性基团， 可见在结构修饰改善水溶性时不能破坏次甲二氧基。

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Solubility and hepatoprotective effect of sauchinone and its derivatives

XU Chun-lei1， XUE Ping2， WU Yu-lan1， ZHANG Fang1， LIXiang1*
（1.College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 2.Changzhou Institute for Drug Control， Changzhou 213003， China）

sauchinone； derivative； solubility； oil/water partition coefficient； HPLC； hepatoprotective effect

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-0960-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.017

2013-08-14

国家自然科学基金青年项目 （81102899）； 江苏省高校自然科学研究项目 （12KJB360006）； 南京中医药大学校青年自然科学基金项目 （11XZR11）

徐春蕾 （1978—） ， 女， 讲师， 博士， 研究方向： 天然药物化学。 Tel： 13915967347， E-mail： xcl127@163.com

*通信作者： 李 祥 （1953—） ， 女， 教授， 博士， 研究方向： 天然药物化学。 Tel： 13913925677， E-mail： lixiang_8182@163.com